HPLC-MS/MS法測定血漿中莫西沙星濃度

梅和坤，王 睿，白 楠，梁蓓蓓，曹 江，汶 柯，唐銘婧，劉銀萍，李 悅，王 瑾（解放軍總醫院藥物臨床研究中心，北京 100853）

莫西沙星屬第四代新型氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，通過抑制細菌的DNA螺旋酶A亞單位和拓撲異構酶IV的活性，阻斷DNA的復制，發揮殺菌作用。莫西沙星對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及非典型病原體（支原體、衣原體、軍團桿菌）均有良好的抗菌活性，具有組織滲透力強、生物利用度高、作用時間長、不良反應少等優點[1-2]。目前，血漿中莫西沙星濃度的測定主要采用紫外、熒光或質譜法[3-11]，而紫外法存在靈敏度低、干擾大和選擇性差等問題，質譜法[4,10]測定采用固相萃取技術，固相萃取操作繁瑣，成本高。本實驗采用直接沉淀蛋白法，快速、靈敏、簡捷，為莫西沙星的臨床藥動學、生物利用度研究及臨床患者的血藥濃度測定提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

莫西沙星標準品（批號：Y0000703，European Pharmacopeaia，純度96.1%）；左氧氟沙星（內標，批號：130455-201005，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純。

空白血漿來自解放軍總醫院輸血科。

Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6410B型三重四極桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；METTLER XS105型天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；SIGMA-15PK型高速低溫離心機（德國SIGMA公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為ZORBAX EP-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美國Agilent公司）；流動相為甲醇-水（45∶55，v/v），其中水相中含0.05%甲酸；流速為0.2 mL·min-1；進樣量為10 μL；柱溫為25 ℃。

1.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子化源（ESI），正離子模式；毛細管電壓：4000 V；溫度：350 ℃；霧化器（N2）壓力：35 psi；干燥氣流速為10 L·min-1；掃描方式為多重反應離子監測（MRM）；莫西沙星的離子對為m/z402.1→m/z384.3，毛細管出口電壓為120 V；碰撞能量：CE = 25 ev；左氧氟沙星的離子對為m/z362.4→m/z261.2，毛細管出口電壓為135 V；用于分析的離子碰撞能量：CE = 35 ev。

1.4 標準溶液的配制

莫西沙星標準溶液的配制 精密稱取莫西沙星標準品26.01 mg（純度為96.1%，含莫西沙星25 mg），置于25 mL容量瓶，以甲醇定容，配成1 mg·mL-1儲備液，避光、恒溫4 ℃保存。取該儲備液以甲醇依次倍比稀釋，配成莫西沙星濃度為50，100，250，500，2000，5000，10 000 ng·mL-1的系列標準溶液，4 ℃保存備用。

左氧氟沙星標準溶液的配制 精密稱取左氧氟沙星對照品25.5 mg（純度為98%），置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg·mL-1的內標儲備液，取該儲備液以甲醇倍比稀釋至1 μg·mL-1，作為內標工作溶液置于4 ℃冰箱保存待用。

1.5 血漿樣品處理方法

將樣品從-80 ℃冰箱取出，室溫下自然融化。精密吸取血漿樣品100 μL置于潔凈EP管中，依次加入1μg·mL-1內標儲備液100 μL和甲醇溶液800 μL，渦旋混勻1 min后，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清液進樣分析。

2 結果

2.1 質譜分析

莫西沙星和左氧氟沙星的子離子掃描圖見圖1和圖2。

2.2 方法的專屬性

圖1 莫西沙星的子離子掃描圖Fig 1 Product ion scan of moxifloxacin

圖2 左氧氟沙星的子離子掃描圖Fig 2 Product ion scan of levofloxacin

取6名不同健康人的空白血漿，除不加內標外，按照“血漿樣品處理方法”處理，得到典型圖譜A。取一定濃度的莫西沙星血漿溶液加入內標，按照“血漿樣品處理方法”處理，得到色譜圖B、C。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾莫西沙星和內標左氧氟沙星的測定。具體見圖3。

2.3 標準曲線和定量范圍

取空白血漿100 μL加入莫西沙星系列標準溶液，配制成相當于血漿濃度為50，100，250，500，2000，5000，10 000 ng·mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項下操作，取10 μL進樣分析，記錄色譜圖，以莫西沙星濃度與內標濃度之比為橫坐標，系列標準血漿樣品測得的莫西沙星的峰面積與內標左氧氟沙星的峰面積比值為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸[12]求得標準曲線回歸方程為Y= 2.614 6X+ 0.043 6（r= 0.996），線性范圍50 ～ 10 000 ng·mL-1。

2.4 定量下限

將50 ng·mL-1的莫西沙星待測物進行6樣本分析，并根據當日的標準曲線求得每一樣本的濃度，求得莫西沙星的濃度均值為（56.45±1.91） ng·mL-1，RSD為3.38%，準確度為106.9% ～ 113.6%。結果表明，該方法下莫西沙星待測物濃度定量下限可達到50 ng·mL-1。

2.5 精密度和提取回收率

圖3 血漿中莫西沙星和內標左氧氟沙星的色譜圖

分別配制濃度為100，500，5000 ng·mL-1的血漿樣品作為質控（QC）樣品，按血漿樣品處理方法項操作，每一濃度平行配制、測定6個樣本，連續測定3 d，根據當日的標準曲線計算QC樣品濃度，計算準確度和精密度。結果表明，該方法的準確度為90.04% ～109.79%，日內精密度RSD ≤3.81%，日間精密度RSD ≤4.26%，說明該方法的準確度和精密度良好。具體見表1。

精密吸取空白血漿100 μL置于一潔凈EP管中，依次加入1 μg·mL-1內標儲備液100 μL和甲醇溶液800 μL，渦旋混勻1 min后，再加入莫西沙星系列標準溶液100 μL，混勻，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清進樣分析。與當日高、中、低三個濃度的QC樣本的峰面積比較，計算提取回收率。結果表明，高、中、低三個濃度下藥物的提取回收率比較穩定。具體見表2。

表2 基質效應對莫西沙星血藥濃度的影響. n = 9Tab 2 The matrix effect on the concentration of moxifloxacin in human serum. n = 9

2.6 樣品穩定性

制備莫西沙星低、中、高三個濃度（100，500和5000 ng·mL-1）的血清樣品，分別在室溫放置4 h、-80℃反復凍融3次和處理后樣本自動進樣器放置24 h考察其穩定性，結果表明樣品在上述條件下均穩定（RE ＜9.61%）。

2.7 基質效應

精密吸取去離子水100 μL置于一潔凈EP管中，依次加入莫西沙星系列標準溶液100 μL，1 μg·mL-1內標儲備液100 μL和甲醇溶液700 μL，渦旋混勻1 min后，再加入莫西沙星系列標準溶液，混勻，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清液進樣分析，與當日高、中、低三個濃度的QC樣本的峰面積比較。結果表明基質效應不影響藥物的測定。

3 討論

本實驗建立了HPLC-MS/MS法檢測人血漿中莫西沙星濃度的方法，特異性強，定量下限低，靈敏度高，并且本方法較以往的檢測方法有如下改進：（1）標準曲線各濃度點與檢測系統檢測性能相適應，線性良好，定量準確。實驗過程中將定量上限提高到10 000 ng·mL-1，定量下限降至50 ng·mL-1，在實際應用中能夠檢測到給藥后5個半衰期以上的藥物濃度，完全符合應用中的定量需要，絕大多數藥物濃度均落在該線性范圍內。（2）在對含藥血漿的前處理方面，高效液相法可以采用沉淀能力強的高氯酸、三氟乙酸等沉淀劑，而HPLC-MS/MS法往往不能使用此類沉淀劑，甲醇乙腈沉淀法對血漿的稀釋倍數較大，同時為了減小基質效應往往也需要加大稀釋倍數，這樣甲醇直接沉淀法就可能難以達到所要求的定量下限。本實驗改進了血漿前處理方法，未采用以往文獻報道的液質聯用法的固相萃取[4,10]，高效液相色譜法的液液萃取[13-14]和氮氣吹干法[11]，而采用甲醇直接沉淀法，改進血漿處理方法后，減少了定量操作的步驟，使定量更準確，血漿處理更方便，處理效率更高，提高實際測定樣品濃度的實用性。該方法可以高效、準確的測定血漿中莫西沙星的濃度，適用于莫西沙星藥代動力學測定。

表1 莫西沙星血漿濃度測定方法的精密度和提取回收率. n = 18Tab 1 Precision and recovery of moxifloxacin in human serum. n = 18

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