氧化苦參堿通過ERK途徑影響SGC7901胃癌細胞增殖的作用機制

王俊霞 王超 呂品田

胃癌是臨床常見的腫瘤疾病之一，傳統的放療和化療對晚期胃癌達不到令人滿意的療效，抗腫瘤細胞增殖的藥物被認為是比較有前途的抗癌藥物。氧化苦參堿(OXY)是中藥苦參的主要生物堿之一，研究表明，OXY在體外能抑制人的胰腺癌［1］、卵巢癌［2］等多種腫瘤細胞的生長，但OXY對胃癌細胞增殖的作用及機制筆者尚未見報道。本研究旨在觀察OXY對人胃癌SGC7901細胞增殖、增殖相關因子PCNA的影響，并探討OXY調控PCNA抗腫瘤的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人胃癌敏感細胞株SGC7901購自中科院上海細胞所。

1.1.2 主要試劑：氧化苦參堿(OXY)購自寶雞永嘉天然植物開發有限公司;磺酰羅丹明(SRB)購自IL公司;PD98059購自Sigma公司;p38絲裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)抗體購自Cell Signaling Technology公司;PCNA、GAPDH引物由上海生工生物技術公司合成，PCNA(302 bp)：5’-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3’(上 游)，5’-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3’(下游);GAPDH(452 bp)：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(上游)，5’-TCCACCACCCTGTTGCTG-3’(下游)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：SGC7901細胞培養于含10%小牛血清的RPMI 1640中，于5%CO2，37℃恒溫培養箱中常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 SRB法檢測OXY的細胞毒性：取對數生長期的SGC7901細胞分組實驗，每組設6個復孔，實驗組加入OXY(使終濃度分別為1.0、2.0、4.0 mg/ml);對照組加入等體積的培養液。作用48 h后進行SRB法，酶標儀545 nm處測定每孔OD值，計算細胞生長抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 流式細胞術(FCM)測定細胞周期：SGC7901細胞加入1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY作用48 h，對照組加入等體積培養液，收集細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.4 OXY對SGC7901細胞PCNA表達的影響：SGC7901細胞分為OXY組(4.0 mg/ml OXY)和對照組(培養液)，作用48 h后收集細胞，實時熒光定量PCR(QPCR)檢測PCNA mRNA的表達，擴增完成后，將對照組設為1，以PCNA/GAPDH的比值RQ用于統計分析;蛋白質印跡(Western blot)法檢測PCNA蛋白的表達，最后以PCNA光密度值/GAPDH光密度值的比值作為PCNA的相對蛋白表達水平。

1.2.5 OXY 對 SGC7901細胞 p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白表達的影響：SGC7901細胞分為OXY組(4.0 mg/ml OXY)和對照組(培養液)，作用48 h后收集細胞，Western blot檢測 p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白的表達。

1.2.6 阻斷ERK通路時OXY作用的SGC7901細胞中PCNA蛋白表達的影響：SGC7901細胞分為：OXY組(4.0 mg/ml OXY)、OXY+ERK抑制劑PD98059干預組(PD組，20μmol/L PD98059作用1 h后再加入4.0 mg/ml OXY繼續培養48 h)和對照組(培養液)。收集細胞，Western blot檢測PCNA、ERK、p-ERK蛋白的表達。

1.3 統計學分析應用SPSS11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OXY對胃癌SGC7901細胞抑制率的影響 OXY對胃癌SGC7901細胞有抑制作用，1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY抑制率分別為(14±4)%、(49±6)%、(67±9)%，可見隨著OXY濃度增大，抑制率明顯上升。

2.2 OXY對胃癌SGC7901細胞周期的影響 與對照組比，1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY 處理 SGC7901細胞后，G1期的細胞均顯著增加(P＜0.05或＜0.01)，S期細胞明顯減少(P＜0.01)。見表1。

表1 OXY對胃癌SGC7901細胞周期分布的影響n=6，%，±s

表1 OXY對胃癌SGC7901細胞周期分布的影響n=6，%，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

2.0 75±11# 10.9±2.2# 14±4 4.0 76±12# 8.6±1.4#15±3

2.3 OXY對胃癌SGC7901細胞PCNA表達的影響 4.0 mg/ml OXY處理細胞48 h后，OXY組細胞PCNA mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05或＜0.01)。見表2。

表2 OXY對胃癌SGC7901細胞PCNA表達的影響n=3，±s

表2 OXY對胃癌SGC7901細胞PCNA表達的影響n=3，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

OXY組 0.32±0.010.24±0.03

2.4 OXY對胃癌SGC7901細胞p38MAPK、JNK、ERK及磷酸化的影響 經4.0 mg/ml OXY處理48 h細胞后ERK的磷酸化受到明顯抑制，與對照組比差異有統計學意義(P＜0.05)，但ERK蛋白表達、p38MAPK、JNK及磷酸化表達均無明顯變化(P＞0.05)。見表3。

表3 OXY對胃癌SGC7901細胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表達n=3，±s

表3 OXY對胃癌SGC7901細胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表達n=3，±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

OXY組 0.39±0.08 0.59±0.07 0.69±0.09 0.41±0.05 0.42±0.05 0.42±0.06*

2.5 阻斷ERK通路時OXY作用的SGC7901細胞中PCNA蛋白表達變化 與對照組比較，OXY組PCNA、p-ERK表達均明顯下降(P＜0.05)，預先加入ERK抑制劑PD98059的PD組與OXY組比較，PCNA表達明顯上升(P＜0.05)，p-ERK的水平進一步下降(P＜0.05)，表明ERK抑制劑PD98059可以協同OXY抑制p-ERK的表達。見表4。

表4 3組細胞中PCNA、ERK、p-ERK的表達變化n=3，±s

表4 3組細胞中PCNA、ERK、p-ERK的表達變化n=3，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05;與OXY組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

PD組 0.58±0.110.43±0.05 0.21±0.03

3 討論

OXY具有廣泛的藥理活性，具有抗菌、抗病毒的作用，最近其抗腫瘤及耐藥性［3］的作用也逐步引起人們的關注。OXY能通過抗增殖的作用抑制卵巢癌等細胞的生長，我們的SRB實驗發現OXY尚能抑制人胃癌SGC7901細胞增殖，其濃度及抑制率與張瓊等［2］在卵巢癌中的報道基本一致。

細胞正常的分裂、增殖、分化與衰老維持著機體自身的穩定，細胞周期的異常會導致這一系列過程的紊亂，導致腫瘤的發生。觀察到OXY可使胃癌細胞周期發生變化，G1期細胞均顯著增加，S期細胞明顯減少。蛋白PCNA的表達與細胞周期密切相關，能夠反映細胞增殖分數和所處的周期［4］，本結果顯示OXY能夠下調PCNA的表達，從而發揮抗腫瘤增殖的作用。

MAPKs信號通路是細胞賴以接受外界刺激信號并作出相應反應的重要傳導通路，參與了細胞增殖、分化、凋亡等過程［5］。本結果顯示OXY干預SGC7901細胞后，ERK的磷酸化水平明顯下降，但ERK蛋白表達、p38MAPK、JNK及磷酸化表達均無變化。ERKs信號通路與細胞的增殖分化密切相關［6］，本實驗中，預先加入ERK抑制劑PD98059［7］可以協同OXY抑制p-ERK的表達，提示OXY能通過抑制MAPK/ERK信號通路中的關鍵信號分子ERK的磷酸化而抑制胃癌細胞的增殖過程。綜合 OXY對細胞周期的影響結果，推測 OXY調控SGC7901細胞增殖可能的途徑為：抑制ERK磷酸化→G1期CDK復合物減少→S期抑制因子增多→細胞增殖阻滯于S期→細胞停止增殖→PCNA表達下降。這一途徑的闡明，為開發胃癌治療藥物提供了實驗依據。

1 冀潤利，邸瑤，夏時海，等.氧化苦參堿對SW1990細胞MMP-2表達的抑制作用及對細胞侵襲力的影響.世界華人消化雜志，2011，19：19-24.

2 張瓊，潘平東.氧化苦參堿對人卵巢癌HO-8910細胞的作用及其機制的初步研究.醫學信息，2010，23：3381-3383.

3 呂建裕，趙瑛.氧化苦參堿逆轉MCF-7/ADM耐藥的研究.中國現代醫生，2010，48：86-87.

4 Czyzewska J，Guzińska-Ustymowicz K，Pryczynicz A，et al.Immunohistochemical evaluation of Ki-67，PCNA and MCM2 proteins proliferation index(PI)in advanced gastric cancer.Folia Histochem Cytobiol，2009，47：289-296.

5 Shigematsu H，Yoshida K，Sanada Y，et al.Rapamycin enhances chemotherapy-induced cytotoxicity by inhibiting the expressions of TSand ERK in gastric cancer cells.Int J Cancer，2010，126：2716-2725.

6 Lo HW.Targeting Ras-RAF-ERK and its interactive pathways as a novel therapy for malignant gliomas.Curr Cancer Drug Targets，2010，10：840-848.

7 Rasola A，Sciacovelli M，Chiara F，et al.Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition.Proc Natl Acad Sci U SA，2010，107：726-731.