大豆根際土壤中自生固氮菌的分離及鑒定

曹陽

【摘 要】采用選擇性培養(yǎng)基法，在大豆田采集的土壤中分離出自生固氮菌菌株，并對其進行了形態(tài)特征、分子檢測。結果表明：形態(tài)觀察為自生固氮菌，采用特異性引物PCR檢測，能擴增出分子量為1500 bp的特異性條帶。結合形態(tài)和分子檢測，鑒定為自生固氮菌Azotobacter。

【關鍵詞】自生固氮菌；分離；鑒定；分子檢測

自生固氮菌廣泛生存在土壤中，能在常溫常壓條件下，通過其體內(nèi)固氮酶的作用，把空氣中的氮固定下來形成氨，進一步變成植物可以利用的氮素，對增加農(nóng)作物產(chǎn)量起著重要作用。自生固氮菌除固氮促進植物生長外，更重要的是它們能夠產(chǎn)生多種植物激素類物質(zhì)促進植物生長[1]。研究表明自生固氮菌可以有效提高多種糧食作物的產(chǎn)量[2-4]。

大豆在世界上不論是總產(chǎn)量或是國際貿(mào)易等方面都是重要的糧食作物[5]。近年來，國內(nèi)市場供需矛盾日益突出，提高大豆產(chǎn)量以滿足不斷增長的市場需求已迫在眉睫[6]。研究自生固氮菌的分離及鑒定，并且將傳統(tǒng)的自生固氮菌形態(tài)鑒定方法與分子生物學相結合，旨在為進一步開展自生固氮菌的研究，提高大豆產(chǎn)量，改善大豆品質(zhì)等奠定基礎。

一、材料與方法

（一）試驗材料

（1）供試土壤

隨機選取15株長勢良好的大豆植株，去除表層5cm厚的雜物，采集10～20 cm厚土層土樣約2 000g。將采集的15株大豆植株根際土壤充分混勻，組成1個混合樣品。

（2）培養(yǎng)基

自生固氮菌培養(yǎng)基：葡萄糖 （或甘露醇）10g、氯化鈉0.2g、磷酸二氫鉀0.2g、CaSO42H2O 0.1g、MgSO4 0.2 g、CaCO3 5 g、蒸餾水1000毫升，自然pH。

（二）自生固氮菌分離

（1）把采集的用于測定的土樣，用1/100天平稱取10g后加入盛有100ml無菌水的250ml三角瓶中，在振蕩器上振蕩15min，使土樣均勻分散成土壤懸液。

（2）吸取1 ml土懸液至9 ml稀釋液中，依次按10倍稀釋，稀釋為10-2，10-3，10-43個梯度，所用的移液器每次吸取土懸液時，在稀釋液中反復吸入吹出3～5次，使管壁吸附部分飽和以減少因管壁吸附而造成的誤差，并使懸液進一步分散。

（3）混菌法進行接種。吸取濃度10-4土懸液1ml于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷卻至45℃的選擇性培養(yǎng)基約20ml，與培養(yǎng)皿中的土懸液充分混勻，重復5次。待凝固后倒置于26～30℃保溫培養(yǎng)48～72h。

（4）挑取單菌落，經(jīng)鏡檢確認為純培養(yǎng)物后，置于試管斜面在-20℃冰箱中保藏。

（三）菌落形態(tài)鑒定

選取單個菌落在選擇性培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，適宜的溫度下（25～28℃）連續(xù)培養(yǎng)3-4d，觀察菌落邊緣、表面質(zhì)地和顏色等形態(tài)變化。

（四）菌株分子鑒定

（1）菌絲體的準備

采用LB液體培養(yǎng)基，在28℃，150 rmim-1振蕩培養(yǎng)24h，10 000 rmim-1離心收集菌體。

（2）DNA的提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA（天根試劑公司，中國北京）

1、取細菌培養(yǎng)液1-5ml，10，000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清。

2、向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。

3、向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混勻。

4、加入220μL緩沖液GB，振蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5、加220μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7、吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD（使用前請檢查是否已加入無水乙醇），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前請檢查是否已加入無水乙醇），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

9、向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

10、將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11、將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

（3）DNA樣品的檢測

質(zhì)量分數(shù)為0.9%的瓊脂糖凝膠中，在電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120 V 的條件下電泳20 min，用溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察電泳條帶，進行拍照。

（4）PCR

以菌體DNA為模板，正向引物P1：（AgA gTT TgA TCC Tgg CTC Ag），反向引物P2：（Aag gAg gTg ATC CAg CCg CA） [7]

PCR反應體系：PCR反應總體積50μL，25 mmolL-1 Mg2+，菌體DNA 2μL，2.5mmolL-1 dNTPs 2μL，20 μmolL-1正向引物2μL，20μmolL-1反向引物2μL，10×Ex Taq緩沖液5μL，Taq酶（5 U/μL）0.5μL。

PCR反應條件：95℃預變性6 min；94℃ 1min，58℃ 45S，72℃ 90S，進行40個循環(huán)；72℃延伸5min。

（5）測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

將以分離得到的菌染色體DNA為模板，PCR擴增，最后進行測序，將該序列送入Genbank數(shù)據(jù)庫利用Blast軟件與登錄的16SrDNA序列進行同源性比較。采用軟件MEGA 4將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中親緣關系最近的已知微生物構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

二、結果與分析

（一）菌種分離與鑒定

本實驗采用自生固氮菌的選擇性培養(yǎng)基從土壤中分離出的菌，革蘭氏染色見圖1，初步鑒定為自生固氮菌，命名為ZS-1。

（1）形態(tài)分析

通過分離篩選命名為ZS-1的細菌，革蘭氏染色呈陰性，卵圓形或圓形。經(jīng)過三四天的培養(yǎng)，細胞單獨存在或成對的菌體呈“8”字形排列（圖1）。

圖1 菌體形態(tài)（28℃ 3d）

（2）16S rDNA分析結果

對細菌ZS-1進行PCR擴增所得到的16SrDNA片段電泳檢測結果見圖2，從圖中可以看到，菌株獲得了片段長度約為1500bp的16SrDNA條帶。

圖2 菌株ZS-1非特異性PCR擴增結果

圖2中：泳道1空白對照 ，泳道2為ZS-1菌株的樣品；泳道M為DNA Mark 5000。

（3）序列的同源性檢索及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序的結果序列送入Genbank數(shù)據(jù)庫通過blastn程序與GenBank中核酸序列進行比對分析，結果顯示ZS-1與Azotobacter屬普遍具有較高的相似性，篩選相似性較高的典型菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用于構建細菌ZS-1系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株名稱、編號及其在GeneBank中序列登記號為：Azotobacter chroococcum（EU930421.1）、Azotobacter beijerinckii（AB429527.1）、Azotobacter chroococcum（EF620428.1）、Azotobacter beijerinckii（AB429526.1）、Azotobacter chroococcum （AB175653.1）、Pseudomonas sp. GD6（GU566307.1）、Pseudomonas sp. D22（GU566356.1）、Pseudomonasstutzeri（GQ402828.1）、Azotobacter chroococcum（EF620440.1）、Azotobacter chroococcum（EF620427.1）。ZS-1及相關菌株基于16S rDNA區(qū)域序列構建系統(tǒng)進化樹（圖3）， ZS-1與Azotobacter chroococcum（EU930421.1）處于同一分支，表明兩者親緣關系最近，相似性可達99.80%。該菌株在生長特點及菌落形態(tài)方面均與固氮菌屬符合，據(jù)此初步鑒定該菌株就是自生固氮菌Azotobacter。

圖3 ZS-1系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（如下圖）

三、討論

東北地區(qū)是我國大豆主產(chǎn)區(qū)，特別是黑龍江省大豆播種面積較大，致使重迎茬等現(xiàn)象不斷加重，造成大豆減產(chǎn)、品質(zhì)下降[8-9]。自生固氮菌能促進植物生長外，提高植物的抗逆性，保證了植物和土壤的生產(chǎn)能力并維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[10]。因此自生固氮菌的這種特性必將應用于大豆生產(chǎn)中，具有廣闊的發(fā)展前景。本研究從大豆根際土壤中分離鑒定出自生固氮菌Azotobacter，為今后大豆自生固氮菌群的進一步深入研究及應用奠定了良好的基礎。

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