亞低溫對腦出血后內源性神經干細胞增殖及遷移的影響

解燕春 關景霞 周 琴 梁靜靜 曾艷平

成年哺乳動物腦內側腦室下區（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）存在神經干細胞（neural stem cells，NSCs）［1］。近年來研究證實［2］，腦出血能激活內源性NSCs增殖，并遷移至血腫周圍，從而促進腦出血后的神經修復。亞低溫能否促進腦出血后內源性神經再生尚不清楚，本實驗通過動態觀察腦出血在亞低溫干預后同側SVZ及血腫周圍NSCs，探討其對腦出血后內源性NSCs的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作及分組

健康雄性清潔級SD大鼠48只，體重（200±20）g。SD大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，頭皮正中切開，剪開骨膜，暴露前囟，于顱骨背側前囟后0.2 mm，中線旁3mm處鉆一直徑為2 mm的孔。用固定于立體定位儀上30號無菌針頭沿針孔垂直進針，進針深度為5.8 mm（此為尾狀核的位置），注射溶有膠原酶0.4IU的生理鹽水2μl。隨機分為對照組和亞低溫組，每組又分為7、14、21、28 d四個亞組，每亞組6只大鼠。對照組肛溫保持在（37±0.5）℃，亞低溫組術后立即開始誘導亞低溫，且持續24 h。

1.2 亞低溫處理

亞低溫組予以冰袋加全身噴灑稀釋乙醇降溫，用電子溫度計 （歐姆龍大連有限公司）監測深部肛溫（插入深度≥5 cm），每30 min測量一次肛溫，溫度控制在（34±1）℃，當肛溫低于33℃時，用60 W白熾燈照射大鼠軀干部升溫，24 h后撤去冰塊及白熾燈，使體溫自然恢復正常。

1.3 NSCs的標記

腦出血模型制作后腹腔注射細胞增殖特異性標記物BrdU（10 mg／ml溶于生理鹽水，50 mg·kg－1·次－1）標記處于增殖狀態的 NSCs，2次／d，直至在相應的時間點處死大鼠。

1.4 BrdU免疫組織化學染色

各組動物在相應的時間點經心臟進行灌注，斷頭取腦，以注入針道為中心，冠狀切下組織塊，厚約4 mm，剩余部分棄去。組織塊放入4% 多聚甲醛內，后固定4 h，換入20%蔗糖溶液中過夜至組織塊沉底。標本用恒溫冰凍切片機經血腫中心作連續冠狀切片，片厚5μm，將切片置于50%甲酰胺2×SSC溶液中65℃溫水浴2 h，再置于2N HCl溶液中37℃溫水浴30 min進行DNA變性，再用0.1 mol／L硼酸漂洗10 min后以3%H2O2覆蓋30 min以封閉內源性過氧化物酶；然后進行親和素－生物素法染色，一抗為小鼠抗大鼠BrdU，二抗為生物素化的馬抗小鼠抗體，DAB顯色后，進行水洗、脫水、透明、封片。

1.5 圖像及統計學處理

采用HPIAS圖像分析系統對同側SVZ及血腫周圍進行圖像分析，每張切片對應部位隨機抽取8個不重復的高倍視野，進行陽性細胞計數，數據用±s表示。BrdU染色以細胞核內出現棕褐色顆粒為陽性。各組數據用SPSS軟件進行組間t比較，顯著性水平α＝0.05，當P＜0.05時差異具有顯著性意義。

2 結 果

免疫組化方法標記的BrdU陽性細胞呈棕黃色，形態多樣，呈圓形、橢圓形或梭形。正常腦細胞染成藍色。結果顯示腦出血后對照組大鼠同側SVZ和血腫周圍BrdU陽性細胞的表達在7 d時開始增加，14 d達到高峰，21 d后開始下降，直至28 d仍有表達。亞低溫組大鼠7 d，14 d，21 d及28 d同側SVZ和血腫周圍BrdU陽性細胞較對照組明顯增加，且增加的時間較對照組明顯延長（P＜0.01），說明腦出血后亞低溫干預可以促進SVZ的NSCs增殖，并向血腫周圍遷移（圖1、2）。

圖1 腦出血后同側SVZ的BrdU陽性細胞

圖2 腦出血后血腫周圍的BrdU陽性細胞

3 討 論

腦出血是一種嚴重危害人類健康的腦卒中亞型，其死亡率和致殘率高。目前，腦出血的治療，如機械清除血腫、藥物預防腦水腫及降低顱內壓，對腦出血患者功能恢復的作用非常有限。如何更好地促進腦出血患者神經功能的恢復，提高其生活質量，是目前迫切需要解決的問題。

成年哺乳動物腦內NSCs存在于SVZ和SGZ。在生理條件下內源性NSCs可活化增殖，SVZ增殖的NSCs經吻側遷移流（rostral migratory stream，RMS）遷移到嗅球并分化為GABA能顆粒細胞和多巴胺能神經元，參與嗅神經的再生；而SGZ增殖的NSCs則遷移至顆粒細胞層后分化為顆粒細胞，參與海馬神經元的再生。NSCs的發現為各種神經系統疾病帶來新的希望。在各種病理狀態下，如缺血性卒中及腦外傷等可促進內源性神經再生，在一定程度上改善神經功能。近年來，研究發現膠原酶誘導的腦出血可促進內源性NSCs的增殖，新生的神經元能遷移到血腫周圍，這為腦出血后神經修復提供新的思路。本研究主要探討亞低溫能否促進腦出血后NSCs的增殖及遷移。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞有絲分裂的S期，整合入新合成DNA。因此，BrdU陽性細胞可被看作是處于增殖狀態的NSCs。本研究結果顯示腦出血后對照組大鼠同側SVZ和血腫周圍BrdU陽性細胞的表達在7 d時開始增加，14 d達到高峰，21 d后開始下降，直至28 d仍有表達。亞低溫組大鼠各時間點SVZ和血腫周圍BrdU陽性細胞較對照組顯著增加，且增加的時間較對照組明顯延長，差異具有統計學意義，說明腦出血后亞低溫干預可以促進SVZ的NSCs增殖，并向血腫周圍遷移。

研究發現成體腦組織中神經再生和血管新生緊密相連［3］。新生的血管分泌許多可溶性因子可以促進神經干細胞增殖、分化［4］。而且新生的血管是神經干細胞遷移的“腳手架”［5］，指引它遷移到病灶周圍。研究進一步發現新生血管表達血管生成素1（Angiopoietin，Ang1），相鄰的 NSCs表達其受體Tie-2。給予Ang1可促進NSCs向病灶周圍遷移，而拮抗Tie-2則可抑制NSCs向病灶周圍遷移［6］。近年來研究發現腦出血能上調Ang1及其受體Tie－2的表達［7］。Zhou等研究發現凝血酶原能激活腦出血后大鼠血管新生［8］。Lei等研究發現高遷移率族蛋白1可通過促進腦出血后血管新生，從而促進其神經再生及神經功能恢復［9］。我們前期的研究發現亞低溫能促進腦梗死后血管新生［10］。因此，本研究推測亞低溫可能通過促進腦出血后血管新生從而促進內源性NSCs的增殖、遷移，但其具體機制有待進一步研究。

1 Gage FH.Mammalian neural stem cells.Science，2000，287（5457）：1433-1438.

2 Otero L，Zurita M，Bonilla C，et al.Endogenous neurogenesis after intracerebral hemorrhage.Histol Histopathol，2012，27（3）：303-315.

3 Alvarez-Buylla A，Lim DA.For the long run：maintaining germinal niches in the adult brain.Neuron，2004，41（5）：683-686.

4 Shang J，Deguchi K，Ohta Y，et al.Strong neurogenesis，angiogenesis，synaptogenesis， and antifibrosis of hepatocyte growth factor in rats brain after transient middle cerebral artery occlusion.J Neurosci Res，2011，89（1）：86-95.

5 del Zoppo GJ.The neurovascular unit，matrix proteases，and innate inflammation.Ann N Y Acad Sci，2010，1207：46-49.

6 Ohab JJ，Fleming S，Blesch A，et al.A neurovascular niche for neurogenesis after stroke.J Neurosci，2006，26（50）：13007-13016.

7 Zhou H，Tang T，Guo C，et al.Expression of Angiopoietin-1 and the receptor Tie-2 mRNA in rat brains following intracerebral hemorrhage.Acta Neurobiol Exp（Wars），2008，68（2）：147-154.

8 Zhou HJ，Tang T，Cui HJ，et al.Thrombin-triggered angiogenesis in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage.J Neurosurg，2012，117（5）：920-928.

9 Lei C，Lin S，Zhang C，et al.Effects of high-mobility group box1 on cerebral angiogenesis and neurogenesis after intracerebral hemorrhage.Neuroscience，2013，229：12-19.

10 Xie YC，Li CY，Li T，et al.Effect of mild hypothermia on angiogenesis in rats with focal cerebral ischemia.Neurosci Lett，2007，422（2）：87-90.