探析核因子IA在星形細胞中的表達及與患者生存的關系

廣西梧州市桂東人民醫(yī)院（543001）姜洪剛

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院（530011）寧桂蘭 鄭景輝Δ

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占人類所有原發(fā)性顱內(nèi)新生物的40%～50%[1]。傳統(tǒng)膠質(zhì)細胞瘤，依靠細胞形態(tài)學或細胞培養(yǎng)來分類[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類系統(tǒng)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤可細分為星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞或混合少突膠質(zhì)細胞等。在各年齡組的發(fā)病率和死亡率都很高，但對其預后的研究仍較少[3][4][5][6]。核因子I（NFI）家族是專一位點DNA結合蛋白（也被稱為CTF或CATT box轉錄因子），在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有關鍵調(diào)節(jié)作用[7][8]。NFIA參與神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)展的事實表明，它可能會在神腦膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，檢測NFIA在星形膠質(zhì)瘤中的表達并分析神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤與患者的生存之間的關系。結果表明，NFIA在人腦星形細胞瘤的生物學活動中可能發(fā)重要作用。

1 材料和方法

1.1 組織標本 回顧性研究分析從2007年～2012年間在我院的63例患者病理標本。病理審查后，2例保存不當?shù)哪[瘤材料被剔除在外，余下的61例可利用組織樣本用于實驗中。

1.2 免疫組織化學染色 使用免疫組化染色的方法檢查NFIA的表達，首先對標本進行石蠟包埋，脫石蠟后，熱抗原修復20min，使用以下抗體：NFIA1:3000（兔多克隆抗體）和GFAP1:50（小鼠單克隆的IgG1，DAKO）。NFIA多克隆抗體是針對人NFIA 478-492氨基酸的。一抗使用兔IgG作為陰性對照。根據(jù)標準程序進行蘇木精和伊紅（HE）染色。

附圖1 NFIA不同級別的星形細胞瘤的表達×400（A：WHOII中的表達，B：WHOIV中的表達）

1.3 免疫組織化學染色分析 使用Image Pro Plus6.0軟件，由同一病理學科醫(yī)生獨立進行盲法分析，按照WHO的診斷分級標準對樣品先進行病理診斷。NFIA表達的量化分析由2個研究者獨立進行分析。通過計算切片視野中NFIA陽性細胞的數(shù)量占總細胞數(shù)另估比值來確定NFIA的定量表達（視野倍率×400，每個切片3個視野，至少包含200腫瘤細胞）。NFIA染色細胞作為NFIA-表達細胞。由于內(nèi)皮細胞缺乏NFIA免疫反應性被用來作為內(nèi)部背景陰性對照。兩個分析者讀數(shù)的平均值用于統(tǒng)計分析。

1.4 無疾病進展生存期（progression-free survival，PFS） PFS定義為自診斷之日起，最小時間間隔的日期腫瘤的復發(fā)，進展或最后的隨訪。

1.5 數(shù)據(jù)分析 患者的生存分析采用Kaplan-Meier方法，NFIA的表達各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），使用SPSS16.0進行分析。

2 結果

2.1 不同級別人類星形細胞瘤NFIA的表達 NFIA在所有級別的星形細胞瘤腫瘤細胞的細胞核中表達。其在WHO分級較低（WHOI和II）腫瘤細胞高比例表達，與WHO高等級（WHOIII和IV）細胞之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見附圖1和附表。值得注意的是，3例在腫瘤邊緣腫瘤細胞入侵血管周圍。這種表達模式表明NFIA可能在星形細胞瘤的腫瘤轉移中發(fā)揮生物學作用，由于樣本量較少，本文中未做統(tǒng)計，值得進一步研究（見附圖2）。

附圖2 腫瘤邊緣血管周圍細胞NFIA的表達×200

2.2 NFIA在惡性星形膠質(zhì)細胞瘤中的表達與PFS的關系 本組免疫組織化學數(shù)據(jù)顯示，在惡性星形膠質(zhì)細胞瘤高級別腫瘤細胞與低級別腫瘤細胞有較少量表達，WHO III和IV級星形細胞瘤一般預后較差，這提示高NFIA表達與患者的生存有良好相關性。筆者將NFIA的表達按高低分為相等的三個組，根據(jù)患者PFS做了生存分析，結果顯示三組的中位生存時間分別是56、40、32個月，P＝0.004＜0.01。說明PFS明顯的與NFIA表達呈單變量復相關。

3 討論

NFIA是一種在小鼠和鳥類的胚胎發(fā)育過程中早表達、決定星形膠質(zhì)細胞命運的轉錄因子。NFIA是NFI家族的成員之一，Cebolla B[9]研究顯示其在鼠類和鳥類心室發(fā)育中具有關鍵的作用，并且在大鼠的腦和脊髓星形膠質(zhì)細胞分化中具有關鍵調(diào)節(jié)作用，其機制可能是通過轉錄調(diào)控的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達來發(fā)揮作用。此外，在出生后的小鼠大腦中切除NFIA或NFIB，中線的神經(jīng)膠質(zhì)細胞群就會產(chǎn)生發(fā)育缺陷[10]。NFIA在人胎兒前腦的中線結構中也有表達[11]。Scrideli[12]對20例低級別的GBM患者經(jīng)過RT-PCR進行微陳列分析數(shù)據(jù)顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NFI基因證實高表達。本實驗數(shù)據(jù)也顯示NFIA在星形細胞瘤中有不同的表達，它高表達在低等級的星形細胞中。Bernard[13]報道了NFIA與人類白血病的關系，在他的研究中通過對2例慢性惡性骨髓疾病患者研究發(fā)現(xiàn)NFIA一些未知的表達。

盡管本實驗的數(shù)據(jù)提示NFIA參與星形膠質(zhì)細胞的生物學過程，但其機制尚未明確。因NFIA是神經(jīng)膠質(zhì)細胞胚胎發(fā)育過程中必須的。它可在低級星形細胞分化中高表達，也反應其在推進星形細胞分化中的抑制作用。同時，NFIA在胚胎期脊柱中維持神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞特性方面暗示其可能參與腫瘤啟動細胞的作用。這提示一個基于遺傳和細胞背景的復雜作用機制，NFIA表達的具體作用體現(xiàn)在不同的亞型[14][15][16]。如在雞的胚胎成纖維細胞中，NFIA是不致癌的，且它的表達有助于細胞抗致癌基因引起的細胞分化，如jun、fos和myc基因（所有編碼轉錄的因子）[17]。但這些表達NFIA的雞細胞又容易在胞質(zhì)中致癌基因作用下分化如src，raf，ras基因。說明其通過不同的信號轉導通路扮演著不同角色。發(fā)生以上情況的原因可能是很多亞型的不同作用，但在另一個亞型里卻發(fā)現(xiàn)具有促癌作用[18][19]。此外，遺傳背景也能發(fā)揮重要作用，在確定抗癌/促癌功能方面，這些已得到證明。

附表 不同級別人類星形膠質(zhì)細胞瘤NFIA的表達（）

附表 不同級別人類星形膠質(zhì)細胞瘤NFIA的表達（）

注：※與WHOI級比較P＜0.01，＃與WHOII級比較P＜0.01，△與WHOIII級比較P＜0.01。

級別 例數(shù) NFIA（%）WHO I 18 92.52±13.24 WHO II 20 79.69±9.57※WHO III 13 46.24±5.79※＃WHO IV 10 38.76±6.51※?！?/p>

尋找星形細胞瘤的標記，長期以來一直是神經(jīng)病理學家和神經(jīng)腫瘤學家的目標。但如Olig2和STAT3被認為是作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成的標記，都同樣表達在星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞，限定其診斷價值[20][21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，NFIA在不同級別的星形細胞瘤的表達，作為病理分級的標志，尤其是形態(tài)學很難評估的時侯值得關注。

Scrideli等[12]通過實時定量PCR結果顯示，檢測20 GBMS NFIA mRNA的表達高于10個樣品非腫瘤性蛋白質(zhì)超過13倍，但未檢查其與PFS或OS的關系。筆者證明NFIA在星形細胞瘤中的蛋白表達與更長的PFS顯著相關，盡管這是一個相對較小的分析PFS（23名兒童）的患者組。較大規(guī)模的研究，將可以確定NFIA是否可能是一個潛在的星形細胞瘤的預后指標。筆者的免疫組織化學結果在蛋白質(zhì)水平證實了Scrideli等的數(shù)據(jù)。Schuur等[17]觀測的NFIA在雞胚成纖維細胞中的表達，使其能夠抵抗核內(nèi)癌基因改造的結果，NFIA在雞胚成纖維細胞的保護作用說明它可以保護細胞免受進一步轉變事件，但它的損失是暴露細胞使其惡性變的可能性增加。

總之，本實驗表明低級與高級別星形細胞瘤之間的聯(lián)系：NFIA蛋白的表達和改善PFS與高級別星形細胞瘤在兒童中差異表達的NFIA。這是支持REMBRANDT GBM芯片分析數(shù)據(jù)庫。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，在部分血管周圍腫瘤細胞NFIA蛋白呈高度濃縮現(xiàn)象，這提示我們在高等級星形膠質(zhì)細胞瘤中，NFIA參與（或促進或抑制）腫瘤細胞做浸潤和轉移。與此同時，粘附分子ephrin B1和鈣粘蛋白也被證實是NFIA的目標之一[22]，其在腫瘤轉移中的生物學機制值得進一步研究。