脂多糖對牙周膜成纖維細(xì)胞IL-8和RANKL基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

李新月

（天津市口腔醫(yī)院牙周病科，天津300041）

NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL) 是腫瘤壞死因子（t umor necrosis factor，TNF）超家族的成員之一，屬Ⅱ型跨膜蛋白，在骨骼和淋巴組織中RANKLmRNA表達(dá)最高，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中也可檢測到RANKLmRNA的表達(dá)。RANKL能直接啟動破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程,維持破骨細(xì)胞活性，刺激破骨細(xì)胞的分化成熟[1]。白細(xì)胞介素8（interleukin 8，IL－8）是 Cys－X－Cys亞家族趨化因子之一，屬于內(nèi)源性趨化因子，也是誘導(dǎo)型細(xì)胞因子。在內(nèi)毒素和其他一些細(xì)胞因子的刺激下，中性粒細(xì)胞以及骨代謝體系中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都有IL-8的生成[2]。牙周炎癥時，IL-8是重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，同時可以促使破骨細(xì)胞分化、成熟,維持骨吸收活性，參與牙周組織破壞。因此RANKL和IL-8是與牙周炎的發(fā)生發(fā)展以及牙槽骨吸收病理代謝過程密切相關(guān)的兩個重要因子，其表達(dá)受到多種牙周致病刺激因素的影響。而牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g.）是革蘭陰性厭氧菌，是慢性牙周炎的主要致病菌。P.g.胞壁外膜的主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）參與牙槽骨、牙齦、牙周韌帶的炎癥破壞和喪失[3]。目前LPS對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制并不是很清楚。本實驗研究的細(xì)胞是牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLF s），hPDLFs是牙周膜中主要的細(xì)胞成分，存在成纖維細(xì)胞樣和成骨細(xì)胞樣雙重特征，具有干細(xì)胞特性、多向分化的潛能。本實驗旨在研究P.g.LPS對hPDLFs中IL-8和RANKL基因表達(dá)的影響，探討LPS對成骨樣細(xì)胞的骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DME M、胎牛血清（F B S）、青鏈霉素和胰蛋白酶購自Invitrogen公司。P.g.LPS購于Invivogen公司（中國武漢）。EXScriptRT試劑盒，SYBR Premix Ex Taq為Takara（日本東京）公司產(chǎn)品。

1.2 hPDLFs細(xì)胞培養(yǎng) 本研究中采用的hPDLFs來源于因正畸拔除的雙尖牙根中1/3牙周膜組織剪碎成1mm3小組織塊，移植至底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在含10%熱非動化胎牛血清（fe talbovine serum,FB S），青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100μg/m L）的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行組織塊原代培養(yǎng)。當(dāng)hPDLFs完全融合后，按1∶3比例傳代。待第3代細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（去酚紅DMEM，加入10%熱非動化FBS，10-8mol地塞米松，10 mmolβ-甘油磷酸鈉，50μg/mL 抗壞血酸），使hPDLFs骨向分化。傳代至第4代時，1.5×104/cm2密度接種至6孔板，待90%融合后更換不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)hPDLFs 12 h，準(zhǔn)備實驗使用。

1.3 P.g.LPS處理細(xì)胞 將細(xì)胞隨機(jī)分為6組進(jìn)行實驗（每組3個培養(yǎng)皿）。1組：空白對照組，只加入無血清DMEM。2~6組分別加入用無血清DMEM配置的濃度分別為 0.01、0.1、1、10、100mg/L P.g.LPS。6個組處理培養(yǎng)hPDLFs10 h后，用無菌PBS清洗細(xì)胞，胰蛋白酶消化5min，再用含有10%FBS的DMEM停止消化，收集細(xì)胞，-80℃保存。

1.4 提取細(xì)胞總RNA 用無菌PBS洗滌3次，留細(xì)胞團(tuán)加入800μL變性緩沖液（TRIZOL）手動混勻使細(xì)胞成分變性裂解。將勻漿液移至1.5mL Eppendorf管中，15~30℃靜置5min。加入0.2mL氯仿充分混勻15 s，靜置（15~30℃）2~3min，4℃ 12 000 r/min離心15min。取上層水相置于新的EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10min，4℃12 000 r/min離心10min。棄去上清，加入1mL的80%乙醇清洗沉淀，4℃10 000 r/min離心10min（清洗2次）。室溫風(fēng)干沉淀（約20min），用20μLDEPC水溶解沉淀，取2μL稀釋100倍后測OD260值，計算各組細(xì)胞總RNA濃度。

1.5 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）

1.5.1 cDNA模板制備 取1μg總RNA作為模板，用ExScriptRT試劑盒合成cDNA。RT反應(yīng)體系：最終反應(yīng)混合物40μL，其中0.1mol/LDTT 2 μL，5 ×RT-buffer 8 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，RNasi n（40U/μL）0.5μL，Oli go（dT）18（50 pmol/μL）2 μL，M-MLV（200U/μL）1 μL，RNA 模板 1 μg，DEPC水加至40μL。RT反應(yīng)條件：42℃/1 h，95℃/5 min，產(chǎn)物-20℃凍存，待做實時定量PCR。

1.5.2 Real-time PCR 所用 IL-8、RANKL和 βactin引物序列由天津灝洋生物有限公司設(shè)計制作（表1）。R eal-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：最終反應(yīng)混合物 20μL，其中 2×SYBR Premix EX Taq 10μL，0.2 μmol/L上下游引物各 1μL，25 ng cDNA模板 2.0 μL，ddH2O加至20μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃/10min，1循環(huán)；IL-8和RANKL擴(kuò)增反應(yīng)94℃/20 s，退火56℃/20 s，40個循環(huán)；最后熔解反應(yīng)：95℃/5 s，56℃/30 s，95℃/15 s。PCR擴(kuò)增后的溶解曲線用來觀察擴(kuò)增后產(chǎn)物的特異性。IL-8和RANKL原始RNA的值由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到定量，β-actin作為組內(nèi)對照。以空白對照組的數(shù)值設(shè)為1，其它組數(shù)值與其計算比值。獨立的RNA樣本重復(fù)3次實驗，結(jié)果取平均值，計算標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab 1 Primersof real-tim e PCR

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗，不同濃度處理組的IL-8mRNA/β-actinmRNA 比值或 RANKLmRNA/β-actinmRNA比值分別與空白對照組進(jìn)行比較，計算P值。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的P.g.LPS對hPDLFs中IL-8mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié) 分別用0.01、0.1、1、10、100mg/L P.g.LPS刺激hPDLFs10 h后,10mg/L P.g.LPS的上調(diào)IL-8mRNA的表達(dá)水平作用最強(qiáng)，達(dá)到峰值，和空白對照組相比增加了 28 倍（P＜0.01）（圖 1）。

2.2 不同濃度的P.g.LPS對hPDLFs中RANKL mRNA 表達(dá)水平的影響 0.01、0.1、1、10、100mg/L P.g.LPS作用hPDLFs 10 h后，RANKLmRNA的表達(dá)同樣呈濃度依賴性升高，而且100mg/L P.g.LPS刺激RANKLmRNA的表達(dá)水平最為顯著，和空白對照組相比增加了 18倍（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 不同濃度的P.g.LPS對hPDLF細(xì)胞中RANKLm RNA表達(dá)的影響Fig 2 Dose-responseeffectsof P.g.LPSon RANKLmRNA express in hPDLFs

3 討論

本實驗結(jié)果表明：P.g.LPS呈濃度依賴性刺激hPDLFs中IL-8和RANKL基因的表達(dá)水平升高，其中10mg/L P.g.LPS對IL-8基因表達(dá)的上調(diào)作用最為明顯，而100mg/L P.g.LPS顯著增強(qiáng)RANKL的基因表達(dá)。

牙周主要致病菌P.g.的胞壁成分LPS除了刺激生成白細(xì)胞介素-1（IL－1），腫瘤壞死因子（TNF－α），前列腺素E2（PGE2）等細(xì)胞因子，直接刺激破骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨吸收以外，同時也誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的炎性溶骨因子的釋放，間接地通過成骨細(xì)胞的作用刺激牙槽骨吸收。本研究為了探討P.g.LPS在牙周病的發(fā)生發(fā)展以及人牙周骨代謝中的作用機(jī)制，采用人牙周膜成纖維細(xì)胞（hPDLFs)的組織塊法原代培養(yǎng)以及細(xì)胞傳代。因為hPDLCs在礦化誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞等方向分化，即骨向分化，同時具有成骨細(xì)胞的表型，所以本實驗以礦化誘導(dǎo)的hPDLFs作為細(xì)胞模型進(jìn)行P.g.LPS對成骨樣細(xì)胞骨代謝調(diào)節(jié)的研究。

本實驗結(jié)果表明10 mg/L P.g.LPS顯著上調(diào)hPDLFs中IL-8mRNA的表達(dá)水平（圖1）。牙周病患牙局部LPS的濃度測定存在很大差異，Elena等[4]的研究表明在未經(jīng)治療的牙周炎患牙的根面上，LPS濃度約為 0.825 EU/mL（≈0.000 1mg/L）；而曾雄群等[5]測定重度牙周炎患牙的齦溝液中LPS的濃度達(dá)到22 540 EU/mL（≈3mg/L），而重度牙周炎同時伴有牙髓炎癥狀的患牙的齦溝液中LPS濃度高達(dá)67 820 EU/mL（≈8mg/L）。以上研究中得到的重度牙周炎患牙的齦溝液中LPS的濃度與本研究中P.g.LPS的有效刺激濃度（10mg/L）基本符合。此外，Sakurai等[6]發(fā)現(xiàn)1mg/LLPS刺激體溫過低的內(nèi)皮細(xì)胞6～96 h后IL-8的蛋白和基因表達(dá)水平降低。因此LPS作用不同種類的細(xì)胞、不同溫度、不同的作用時間，IL-8的表達(dá)變化有所不同。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8的破骨機(jī)制是通過破骨細(xì)胞表面的特異性IL-8受體（CXCR1）的表達(dá)和激活，直接作用破骨細(xì)胞的結(jié)果[7]。人重組IL－8（rhIL－8）也可以增加小鼠成骨細(xì)胞（MC3T3－E1）的RANKLmRNA和蛋白水平的表達(dá)，但是對骨保護(hù)素（osteoprotegeri，OPG）的表達(dá)沒有明顯的影響，IL-8通過增加RANKL/OPG的比例，進(jìn)而刺激破骨細(xì)胞的活性。因此IL-8具有依賴和非依賴RANKL兩種通路刺激人破骨細(xì)胞的作用機(jī)制。

RANKL在刺激破骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)骨吸收中發(fā)揮重要作用。在骨吸收重建機(jī)制中，除了RANKL以外，核因子-κB受體活化因子（receptoractivatorof nuclearfactor-kappa B，RANK）和骨保護(hù)素（OPG）與RANKL一同組成OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)。RANK主要在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（單核和巨噬細(xì)胞系）表達(dá)，是RANKL調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)育過程中不可缺少的信號受體[8]；而OPG為腫瘤壞死因子受體超家族成員，在骨組織中發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化,抑制成熟破骨細(xì)胞活性,誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[9]；RANKL可選擇性地與RANK或OPG結(jié)合，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化或抑制其分化成熟。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是許多骨代謝疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)OPG基因缺失小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松;RANKL/RANK基因敲除的小鼠,出現(xiàn)嚴(yán)重骨質(zhì)硬化癥。它們的失衡與骨破壞性疾病相關(guān)，與牙周炎的牙槽骨破壞也有密切關(guān)系。以往的研究結(jié)果顯示在骨的微環(huán)境中，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL和OPG直接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和骨吸收[10]。許多引起骨吸收的分子可上調(diào)RANKL的表達(dá)，和/或降低OPG的表達(dá)[11]。單純牙周炎組和健康組相比，血清OPG濃度顯著降低，而RANKL濃度略增高，RANKL/OPG比值增大，提示牙周炎時，局部刺激的結(jié)果是骨保護(hù)作用降低，破骨效應(yīng)增強(qiáng)，RANKL/OPG比值變化主要來自O(shè)PG的顯著降低和RANKL的增高。RANKL/OPG之比的升高可能是牙槽骨吸收的關(guān)鍵因素[12]。以上觀點在本實驗結(jié)果中得到部分證實：10、100 mg/L P.g.LPS 刺激 hPDLFs中 RANKL基因表達(dá)明顯升高（圖2），證明高濃度的P.g.LPS可能通過誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞中炎性溶骨因子的釋放，從而間接刺激破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨吸收的機(jī)制。但本研究缺少P.g.LPS對OPG基因表達(dá)影響的檢測，因此缺少P.g.LPS對RANKL/OPG調(diào)節(jié)的評價，需在今后的實驗中進(jìn)一步證實和探討。

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