AURKA蛋白激酶在三陰乳腺癌干細胞形成血管擬態中的實驗研究

劉 營 ，孫保存 ，2，劉鐵菊 ，趙秀蘭 ，李巖磊

（1.天津醫科大學病理學教研室，天津300070；2.天津醫科大學附屬腫瘤醫院病理科，天津300060）

乳腺癌是女性常見腫瘤之一，且許多國家乳腺癌發病率呈上升趨勢[1]。每年大約有20萬患者死于乳腺癌的轉移，大約占全球每年新發乳腺癌患者的20%[2]。乳腺癌干細胞在乳腺癌復發和轉移中起重要作用。AURKA是Aurora激酶家族成員之一，是一種癌基因，在乳腺癌干細胞發展、上皮間充質轉變（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和遠處轉移中起重要作用[3]。目前有關乳腺癌干細胞體外培養的研究較少，本實驗探索用干細胞無血清懸浮培養法從常規培養的乳腺癌MDA-MB-231細胞中分離出乳腺癌干細胞球，RT-PCR檢測干細胞轉錄因子c-myc、sox-2的表達情況，Western blot檢測 AURKA蛋白激酶在常規培養細胞和乳腺癌干細胞球的表達是否存在差異，通過乳腺癌干細胞球三維培養和加入AURKA蛋白激酶抑制劑來判斷AURKA蛋白激酶在乳腺癌干細胞球成血管能力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231由本實驗室保存。DMEM/F12（1∶1）培養基購自 Gibco 公司，表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）和堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自Pepro Tech公司，B27購自Gibco公司，兔抗人AURKA、β-actin、山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物公司。AURKA蛋白激酶抑制劑MLN8237購自Selleckchem公司。

1.2 方法

1.2.1 常規細胞培養 將乳腺癌MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清、青霉素100U/mL和鏈霉素100 U/mL的DMEM培養液，置于37℃﹑5%CO2培養箱中恒濕培養，待細胞長至90%融合時傳代。

1.2.2 干細胞無血清懸浮培養 選取對數生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞胰酶消化，重懸于無血清培養基（DMEM/F12培養基、20μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2%B27） 并計數調整細胞至 1×105個/mL，接種于6孔板中培養。隔天更換1次培養基或者添加生長因子，每天倒置顯微鏡下觀察腫瘤干細胞球形成情況。待培養孔中的腫瘤干細胞球形狀規則、體積較大后，吸取含有腫瘤干細胞球的培養液離心，棄上清，吹打成單細胞懸液按1∶2比例傳代。取第三代腫瘤細胞球進行后續實驗。

1.2.3 RT-PCR檢測 利用Trizol提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量，將2μg總RNA逆轉錄成cDNA用于PCR反應。PCR反應結束后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果用凝膠成像分析儀拍照，圖像用Photoshop軟件進行條帶灰度分析。人 c-myc引物為 F：5′-TACCCTCTCAACGACA GCAG-3′，R：5′-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3′；人 sox-2 引物為 F：5′-GGGAAATGGAGGGGTGCA AAAGAGG-3′，R：5′-TTGCGTGAGTGT GGATGGG ATTGGTG-3′；內參 GAPDH 引物為 F：5′-CCTGGC CAAGGTCATCCATGAC-3′，R：5′-TGTCATACCAG GAAATGAGCTTG-3′。

1.2.4 三維培養 按DMEM與Matrigel膠1∶1進行冰上混勻，后加至96孔板，50μL每孔，在37℃放置待膠凝。常規消化細胞計數后在已凝膠上層加細胞約1×104個，然后放置在37℃、5%CO2培養箱培養。利用倒置顯微鏡觀察三維培養管道形成情況。

1.2.5 Western blot檢測 加入細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，加樣行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入AURKA（1∶2 000）、β-actin（1∶1 000）一抗，在 37 ℃下作用 2 h；用 TBST漂洗3次，每次10min后與山羊抗兔IgG抗體（1∶2 000）反應，37℃作用2 h；然后用TBST漂洗，10 min/次，洗滌3次；在暗室避光X線膠片曝光，進行顯影、定影、拍照。

1.2.6 給予AURKA蛋白激酶抑制劑三維培養 Matrigel膠與DMEM 1:1冰上混勻后，加至96孔板中，50μL每孔，37℃靜置待膠凝。在膠上層加約1×104個細胞，給予 AURKA抑制劑 MLN8237 1 μmol/L，37℃、5%CO2培養箱培養。48 h后在倒置顯微鏡下觀察其管道形成情況。

2 結果

2.1 乳腺癌干細胞球的生長情況 接種于含生長因子無血清培養液中的乳腺癌細胞，24 h后在倒置相差顯微鏡下可見較小的腫瘤干細胞球形成，數量較少，呈類圓形，形狀不規則，大小不一，結構松散。培養至10～14 d，腫瘤干細胞球數量增多，形成由數十個至上百個細胞組成的成熟細胞球，呈懸浮生長，球體進一步增大，呈圓形或卵圓形，折光性強，細胞連接緊密。見圖1。

圖1 無血清懸浮培養獲得的腫瘤干細胞球（×600）Fig 1 Stem cellsspheresobtained from the serum-free suspension culture（×600）

2.2 RT-PCR檢測干細胞轉錄因子 乳腺癌MDA-MB-231細胞經干細胞無血清懸浮培養后，對獲得的乳腺癌干細胞球進行RT-PCR檢測干細胞轉錄因子c-myc、sox-2的表達情況。結果顯示無血清懸浮培養獲得的乳腺癌干細胞球較常規培養細胞高表達干細胞轉錄因子c-myc、sox-2。見圖2。

2.3 Western blot檢測AURKA蛋白激酶 對無血清懸浮培養獲得的乳腺癌干細胞球和常規培養細胞進行Western blot檢測AURKA蛋白激酶表達情況。實驗結果表明：利用無血清懸浮培養獲得的乳腺癌干細胞球中AURKA蛋白激酶表達升高。見圖3。

圖2 RT-PCR檢測干細胞轉錄因子c-myc、sox-2表達Fig 2 The expression of stem cell transcription factor status of c-m yc and sox-2were detected by RT PCR

圖3 Western blot檢測AURKA蛋白激酶在干細胞和常規培養細胞的表達Fig 3 The expression of AURKA protein kinase from stem and normal cellswere detected bywestern blot

2.4 AURKA蛋白激酶抑制劑對乳腺癌干細胞管道形成的影響 采用“ongel”三維培養法觀察細胞管道形成能力。三維培養48 h后可見細胞呈梭狀或多邊形，伸出細長偽足，細胞相互連接形成大量管腔結構，見圖4。加入AURKA蛋白激酶抑制劑后可見細胞聚集呈克隆狀，形成管腔結構明顯減少，見圖5。

圖4 乳腺癌干細胞三維培養（×100）Fig 4 Result of the breast cancer stem cells by three-dim ensional culture（×100）

圖5 加入AURKA蛋白激酶抑制劑后三維培養（×100）Fig 5 AURKA protein kinase inhibitor wereadded to the three dimension alculture（×100）

3 討論

腫瘤組織中存在高致瘤性的腫瘤干細胞，其具有自我更新、多向分化、高致瘤性等特點，在腫瘤的形成和生長過程中起重要作用，被認為是腫瘤發生發展的根源[4]。腫瘤干細胞生物學行為研究對探索腫瘤的發生發展、診斷預后和治療具有重要意義。乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中已經證實存在具有干細胞樣特性的腫瘤細胞群，但對乳腺癌干細胞體外培養的研究較少。干細胞無血清懸浮培養法是分離腫瘤干細胞的一種方法，腫瘤干細胞可在添加了生長因子（EGF、bFGF、B27）的無血清培養基中存活，生長因子EGF、bFGF促進細胞有絲分裂和抑制分化，B27為去除了分化劑的血清替代物，而非腫瘤干細胞則會在這種條件下逐漸凋亡。本實驗探索用干細胞無血清懸浮培養法分離乳腺癌干細胞球，并對獲得的乳腺癌干細胞球檢測干細胞轉錄因子sox-2、c-myc表達，根據實驗結果證實無血清懸浮培養法可從常規培養的乳腺癌細胞中獲得乳腺癌干細胞球。

人AURKA激酶定位于20q13，屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一。AURKA蛋白激酶含有一個高度保守的氨基酸序列催化域，為胞質分裂的關鍵調節子。AURKA蛋白激酶調節中心體復制和分離，其表達降低可形成單極紡錘體，AURKA蛋白激酶高表達可導致中心體的擴增、紡錘體形成異常和基因組的不穩定性。體外研究證實AURKA蛋白激酶過表達導致細胞越過活化的紡錘體檢查點，進入細胞有絲分裂后期，導致異常的細胞分裂、多核細胞和多倍體。AURKA蛋白激酶在惡性腫瘤的發生發展中起重要作用，已在多種惡性腫瘤中如食管癌、喉癌、肝癌、卵巢癌中證實AURKA高表達[5]。本研究發現AURKA蛋白激酶在乳腺癌干細胞球中較常規培養乳腺癌細胞高表達，提示AURKA蛋白激酶在乳腺癌干細胞自我更新和維持中起重要作用。最近的研究中使用果蠅中樞神經系統模型揭示了干細胞自我更新和分化的關鍵分子和機制。果蠅非典型蛋白激酶 C（D rosophila atypical protein kinase C，DaPKC）和定位于腦皮質的腫瘤抑制蛋白Lg1是成神經細胞不對稱性分裂中的關鍵因子。中心體蛋白激酶AURKA為DaPKc不對稱定位時所必需，成神經細胞頂端分裂時指示DaPKC和Lg1定位中AURKA激酶起重要作用。AURKA基因的突變可使果蠅成神經細胞數量增加，AURKA突變體能使成神經細胞外源性自我更新[6-8]，但其具體機制尚有待進一步研究。

1999年Maniotis等發現了獨立于腫瘤血管生成的全新的腫瘤血管模式，即血管生成擬態（vasculogenicmimicry,VM）：在沒有內皮細胞參與下腫瘤細胞通過自身變形和細胞外基質相互作用模仿機體血管生成而形成瘤細胞條索，血液在這種管道系統中流動[9-10]。VM可與宿主血管相連通，使腫瘤血液供應豐富。由于無內皮細胞屏障增加了血道轉移的風險，故具有VM的腫瘤惡性度高，更易發生血道轉移，預后差。現已證實乳腺癌中存在VM，具有VM的乳腺癌惡性程度更高，更易發生轉移，預后更差[11]。有研究發現上皮間充質轉變可促進VM的形成，上皮間充質轉變細胞具有更強的穿透和浸潤能力，可降解細胞外基質，引發血道轉移，是腫瘤細胞向外擴散轉移的起始步驟。AURKA在乳腺癌干細胞發展、EMT和遠處轉移中起重要作用，AURKA可誘導上皮間充質轉變，促進乳腺癌細胞遠處轉移，抑制AURKA激酶可逆轉EMT表型的表達[3]。本實驗乳腺癌干細胞球三維培養可形成大量管腔結構，加入AURKA激酶抑制劑后，乳腺癌腫瘤干細胞球成血管能力減弱，因此，本研究認為AURKA激酶在乳腺癌干細胞上皮間充質轉變和VM形成中起作用，具體調控機制還有待進一步研究，并有望成為抑制乳腺癌血管生成的治療靶點。

綜上所述，本研究提示AURKA激酶在乳腺癌干細胞自我更新和維持、上皮間充質轉變和VM形成中起重要作用，可能成為乳腺癌治療中抑制血管生成和轉移的新的靶點，但其具體機制仍有待進一步研究。

[1]Chao Y L,Shepard CR,Wells A.Breast carcinoma cells re-express E-cadherin duringmesenchymal to epithelial reverting transition[J].MolCancer,2010,9:179

[2]Jemal A,Siegel R,Xu J,etal.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277

[3]Acu ID,Liu T,Suino-Powell K,etal.Coordination of centrosome homeostasis and DNA repair is intact in MCF-7 and disrupted in MDA-MB 231 breastcancer cells[J].Cancer Res,2010,70(8):3320

[4]Hwang-VersluesW W,KuoW H,Chang PH,etal.Multiple lineages of human breast cancer stem/progenitor cells identified by profilingwith stem cellmarkers[J].PLoSOne,2009,4(12):e8377

[5]Baba Y,Nosho K,Shima K,etal.Aurora-A expression is independently associated with ehromosomal instability in colorectal cancer[J].Neoplasia,2009,11(5):418

[6]Shi Y，Sun G，Zhao C,etal.Neural stem cell self-renewal[J].Crit RevOncolHematol，2008,65(1):43

[7]Kim DW，Hirth F.Geneticmechanisms regulating stem cell selfrenewal and differentiation in the central nervous system of Drosophila[J].Cell Adh Migr，2009,3(4):402

[8]Wirtz-Peitz F，Nishimura T，Knoblich JA,etal.Linking cell cycle to asymmetric division:Aurora-A Phosphorylates the Par complex to regulate Numb localization[J].Cell,2008,135(1):161

[9]Liu T J,Sun BC,Zhao X L,etal.CD133+cellswith cancer stem cell characteristics associateswith vasculogenicmimicry in trilenegativebreastcancer[J].Oncogene,2013,32(5):544

[10]Lin P,Wang W,Sun B C,etal.Vasculogenic mimicry is a key prognostic factor for laryngealsquamous cell carcinoma:a new pattern ofblood supply[J].Chin Med J(Egl)，2012,125(19):3445

[11]張沖，孫保存，張丹芳,等Twist1對人乳腺癌細胞E-cadherin表達及亞細胞定位的影響[J].中國腫瘤臨床，2013,40(9):509