不同年齡小鼠缺血性心力衰竭后心室重塑程度的比較*

沈 鑫， 馬依彤， 楊毅寧， 劉 芬， 于子翔， 陳邦黨， 陳 鈾， 黃 鶯

(新疆醫科大學第一附屬醫院冠心病一科，新疆 烏魯木齊 830054)

不同年齡小鼠缺血性心力衰竭后心室重塑程度的比較*

沈 鑫， 馬依彤△， 楊毅寧， 劉 芬， 于子翔， 陳邦黨， 陳 鈾， 黃 鶯

(新疆醫科大學第一附屬醫院冠心病一科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的研究不同年齡小鼠缺血性心衰后心室重塑程度的變化。方法選擇3月齡和18月齡的雄性C57BL/6J小鼠共100只，每個月齡組50只，在2組中分別隨機選取 40只，結扎左冠狀動脈定量控制心梗面積，建立穩定缺血性心衰模型，每組其余10只作為假手術組，于術后8周行心臟超聲評價各組心功能變化；稱量全心臟及左心室重量并計算左心室質量指數(LVMI)；免疫組化檢測心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原表達，Masson染色檢測心肌纖維化的程度并計算心肌間質膠原分數(CVF)。結果與低齡組相比，老齡組心臟破裂率(18%vs10%)和心力衰竭死亡率(22%vs10%)均高于低齡組(P<0.05)；老齡組心室腔明顯增大，心率較快，左室短軸收縮功能障礙更明顯(P<0.05)；老齡組LVMI明顯增加(P<0.05)；老齡組CVF、Ⅰ型膠原的表達以及Ⅰ/Ⅲ型膠原的比值顯著高于低齡組(P<0.05)。結論老齡小鼠缺血性心衰后心肌膠原分布異常，心室重塑程度更重，心功能降低更明顯。

心力衰竭； 心室重塑； 年齡； 膠原

心力衰竭(heart failure，HF)是缺血性心臟病中預后較差的并發癥之一，臨床研究證實老齡是缺血性心力衰竭發生的獨立危險因素，約80%以上的心力衰竭發生于年齡65歲以上的患者[1]，且老齡心肌對缺血缺氧造成的損傷更加敏感，預后更差。所以，開展老齡缺血性心力衰竭的發病機制研究顯得尤為重要，為尋找新的干預措施以提高老齡心衰患者的生存率及生活質量具有重要現實意義。本研究利用不同年齡的缺血性心衰小鼠模型，研究不同年齡小鼠缺血性心衰后心室重塑程度變化。

材 料 和 方 法

1動物、試劑與儀器

近交系C57BL 低齡(3月齡)和老齡(18月齡)小鼠各50只，共100只，體重20～30 g，12 h∶12 h晝夜循環飼養，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，所有操作程序經過動物倫理委員會批準。免疫組化試劑盒及Masson三色染色試劑盒購自福建邁新技術有限公司，Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體購自Abcam。Hardvard 687小動物呼吸機購自Hardvard。顯微鏡購自Leica。

2小鼠缺血性心力衰竭模型的制作

依據文獻[2]建立缺血性心衰動物模型。腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)、甲苯噻嗪(20 mg/kg)、阿托品(1.2 mg/kg)的混合液，麻醉生效后接呼吸機控制呼吸。左側臥位固定，左第五肋間切開撐開胸腔，暴露心臟，看見左冠狀動脈后用6～0號絲線結扎左冠狀動脈，定量控制心肌梗死范圍，形成左心室中等范圍梗死面積(40%～45%)，假手術組為同期開胸但不結扎冠脈，余過程同心力衰竭組。術后6周存活小鼠形成相對穩定的缺血性心力衰竭模型[3]。為使模型更為穩定，故將時間延長2周后以8周存活的小鼠為穩定的缺血性心力衰竭模型。

3術后死亡率的觀察

分別在術后24 h內、術后1周內、術后2～8周內觀察小鼠的死亡率，并對1周內和術后2～8周內死亡的小鼠進行尸體解剖，心臟附近包繞大量血凝塊，或者可以在梗死的室壁上見到破裂口即為心臟破裂死亡；雙肺淤血，心臟重度擴大伴或不伴心包積液，梗死區域擴大且呈暗紅色即為心力衰竭死亡。

4心臟超聲評價心功能

術后8周用惠普5500型彩色多普勒超聲心動圖儀及15 MHz高頻線陣超聲探頭經胸檢測并記錄以下指標：心率(heart rate，HR)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室舒張期外徑(external left ventricular diastolic diameter，EXLVDD)、收縮期和舒張期的前后室壁厚度(thickness of anterior wall of systole，Aws；thickness of posterior wall of systole，Pws；thickness of anterior wall of diastole, Awd； thickness of posterior wall of diastole，Pwd)和短軸縮短率(fractional shortening，FS),FS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%[3]。

5病理學檢測

頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出心臟和肝臟，沿房室溝和室間隔分離出左心室、右心室、心房，將其分別稱重，計算左心室質量指數(left ventricular mass index，LVMI)，LVMI=左心室重量/全心重量；以10%中性甲醛溶液固定左心室，各濃度乙醇梯度脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，切片(5 μm)。HE染色觀察梗死區、交界區瘢痕形成情況及心肌細胞存活的情況；Masson染色(心肌細胞呈紅色，膠原為藍色)鑒定并計算心肌間質膠原分數(collagen volume fraction, CVF)， CVF=心肌膠原面積/所測視野面積；免疫組化測定心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，每張切片隨機選取5個視野，取平均值，應用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)分析圖片數據，并計算Ⅰ/Ⅲ型膠原比值。

6統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0軟件處理分析，組間均數比較用方差分析，百分率的比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1各組死亡率觀察

術后24 h內低齡組死亡3只，老齡組死亡4只；術后7 d內低齡組5只死于心臟破裂，3只死于心力衰竭；老齡組9只死于心臟破裂，4只死于心力衰竭；術后1～8周內，低齡組2只死于心力衰竭，老齡組7只死于心力衰竭，假手術組全部存活。老齡組的總死亡率(48%vs26%)、心臟破裂死亡率(18%vs10%)和心力衰竭死亡率(22%vs10%)均顯著高于低齡組(P<0.05),見圖1。

Figure 1. Mortality of different reasons in the 2 groups.*P<0.05vsyoung group.

圖12組小鼠不同原因的死亡率比較

Figure 2. Pathological results of the hearts in the 2 groups (×400).

圖2各組心衰小鼠心肌組織病理學結果

2心臟超聲結果

各年齡心衰組在8周時均出現明顯的梗死區變薄擴張和收縮功能障礙，與同齡假手術組相比，兩心衰組的LVEDD和LVESD明顯增大(P<0.05),HR明顯增快(P<0.05)，FS均明顯降低(P<0.05)；與低齡心衰組相比，老齡心衰組心室腔明顯增大,HR較快,FS降低更明顯,Pwd低于低齡組(P<0.05),見表1。

表1 術后8周心臟超聲結果

*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

3病理學結果

各年齡組分別與同齡假手術組相比，左室、右室和心房重量明顯增加(P<0.05)，LVMI明顯升高(P<0.05)，肝臟重量顯著降低(P<0.05)；老齡組左室重量及LVMI要顯著高于低齡組(P<0.05)，見表2。與同齡假手術組相比，兩心衰組CVF明顯增高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯增高(P<0.05)；與低齡心衰組相比，老齡心衰組CVF、Ⅰ型膠原以及Ⅰ/Ⅲ比值明顯增高(P<0.05)，但2組Ⅲ型膠原的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表3。

表2 術后8周低齡和老齡小鼠器官重量及LVMI比較

LV: left ventricle； RV: right ventricle； AT: atrium.*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

表3 術后8周各組心肌CVF、Ⅰ和Ⅲ型膠原表達及Ⅰ/Ⅲ比值的比較

*P<0.05vscontrol at the same age；△P<0.05vsHF in young group.

討 論

年齡是心血管病的重要危險因素之一，隨著年齡的增加，心功能及其儲備能力下降，對于伴有基礎性心臟病的老年人來說，更容易發生心力衰竭，然而心力衰竭是個復雜的病理生理過程，老齡心力衰竭患者心室重塑更重，目前機制不是很清楚。研究表明，膠原重建在心室重塑過程中起了非常重要的作用[4-6]。因此，本研究利用不同年齡小鼠建立缺血性心力衰竭模型，觀察了老齡小鼠心衰后左室重塑的程度，并探討了各年齡組心衰心肌膠原的表達變化，闡釋老齡鼠心衰后左室重塑更重的可能原因。

心力衰竭是一個進行性發生發展的過程，涉及復雜的病理生理機制，目前認為，體內神經激素系統長期的過度激活，導致心肌及間質的重塑及細胞凋亡，形成了心衰病理生理的重要環節，阻斷神經激素的激活、延緩、逆轉心室重塑的病理生理過程與惡性循環應是控制心衰發展的關鍵[7]。左心室重塑的病理改變一般有以下兩個方面：一是心肌細胞的肥大、壞死和凋亡，二是成纖維細胞的增生和心肌間質纖維化。而心肌纖維化在心力衰竭的發生和發展中起重要作用。心肌纖維化多體現于心肌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)膠原纖維過量積聚、膠原含量或成分比例發生變化。正常心肌中膠原主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原(占總膠原90%以上)，Ⅰ型膠原屬于成熟型膠原， 抗張強度大， 伸展及回彈性較小；Ⅲ型膠原屬于胚胎型膠原，伸展及回彈性較大，抗張性較差[8-9]，二者是構成ECM主要成分和心肌僵硬的決定性因素。心肌梗死后由于修復性的纖維化形成梗死區疤痕，而非梗死區則呈現反應性纖維化，但心肌膠原含量的2～3倍升高可導致心室舒張期硬度增加和充盈異常，4倍以上的升高可導致心室收縮力的下降[10]。本研究在小鼠心衰模型中發現，無論是低齡還是老齡組，心功能均顯著降低，LVMI明顯升高，而造成的主要原因是心肌纖維化，膠原沉積導致心肌僵硬度增加，收縮功能障礙。本實驗結果顯示心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原均大量的沉積，以Ⅰ型膠原為主，在梗死區域、交界區及非梗死區可見交錯成網狀穿插于間質的膠原纖維，相比低齡組，老齡組膠原沉積更為明顯，Ⅰ型膠原的沉積約為低齡組的2倍，但是Ⅲ型膠原的增加與低齡組相比無明顯統計學差異，這導致Ⅰ/Ⅲ膠原比值顯著高于低齡組，毛宇彬等[11]利用大鼠心梗模型探討心梗不同時期心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原重建研究中發現心梗35 d后左室Ⅰ型膠原的增加明顯，3 d時Ⅲ型膠原的增加明顯，35 d時Ⅲ型膠原的增加的幅度要低于3 d。另外，我們在早期一項年齡和心肌梗死后心臟破裂及心室重塑的研究中也發現，老齡小鼠膠原沉積的速率要顯著高于低齡小鼠[12]，結合本實驗的結果，我們認為老齡鼠左心室重塑時由于Ⅲ型膠原的表達未能及時升高，導致Ⅰ型膠原過度沉積，Ⅰ/Ⅲ膠原比值過度升高，使得心室僵硬度過度增加，從而使得心功能更差，心室重塑更為嚴重。另一方面，在本研究中發現小鼠肝臟重量的減輕，推測是由于慢性心力衰竭的存在，小鼠的術后進食明顯減少，并發生一定的營養代謝障礙。因此，如果能采用有效的干預措施在老齡心室重塑進程中減少膠原的進一步沉積，將有可能延緩心室重塑的進程，從而降低死亡率，改善心功能，改善預后。

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Effectsofdifferentagesonventricularremodelingafterischemicheartfailureinmice

SHEN Xin, MA Yi-tong, YANG Yi-ning, LIU Fen, YU Zi-xiang, CHEN Bang-dang, CHEN You, HUANG Ying

(FirstDepartmentofCoronaryHeartDisease,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China.E-mail:myt-xj@163.com)

AIM: To observe ventricular remodeling induced by ischemic heart failure in the mice at different ages.METHODSThree-month-old (young group,n=50) and 18-month-old (old group,n=50) male C57BL/6J mice were selected in the study. Forty mice underwent ligation of left coronary artery with certain infarct size, and 10 were sham-operated for control. Echocardiography was performed after 8 weeks of infarction. All mice were killed and the hearts were collected for examinations. Masson trichrome staining was used to detect myocardial fibrosis. The expression of type I and type Ⅲ collagens was measured by the method of immunohistochemistry.RESULTSThe incidences of cardiac rupture (18%vs10%,P<0.05) and heart failure (22%vs10%,P<0.05) were significantly higher in aged mice than those in young mice. The degrees of left ventricular dilation, contractile dysfunction and heart rate were significantly higher in aged mice than those in young mice (P<0.05). The left ventricular mass index, collagen volume fraction, the expression of type I collagen and ratio of type Ⅰ/Ⅲ collagens were significantly increased in aged mice as compared with young mice (P<0.05).CONCLUSIONAfter heart failure, aged mice show abnormal collagen distribution, and suffer from worse cardiac functions and more serious ventricular remodeling.

Heart failure; Ventricular remodeling; Age; Collagen

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.005

1000- 4718(2013)06- 0988- 05

2012- 11- 13

2013- 03- 11

973計劃前期研究專項(No.2010CB535013)；國家自然科學基金資助項目(No.81060025)；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20106517110002)；新疆醫科大學第一附屬醫院科研獎勵基金資助項目(No.2010YFY25)

△通訊作者 Tel: 0991-4365381; E-mail: myt-xj@163.com