胰島素與硒合用對糖尿病大鼠心肌重構的影響*

徐天嬌， 曾菊絨△， 胥曉麗， 陳 琳， 彌 曼， 魏 明， 李 萍

(1西安醫學院藥理學教研室，陜西 西安710021； 2陜西省人民醫院病理科，陜西 西安 710068)

胰島素與硒合用對糖尿病大鼠心肌重構的影響*

徐天嬌1， 曾菊絨1△， 胥曉麗1， 陳 琳2， 彌 曼1， 魏 明1， 李 萍1

(1西安醫學院藥理學教研室，陜西 西安710021；2陜西省人民醫院病理科，陜西 西安 710068)

目的觀察胰島素與硒合用對糖尿病心肌病大鼠心肌重構的影響并初步探討其機制。方法SD大鼠經腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，誘導12周后建成糖尿病大鼠心肌重構動物模型。采用One TouchⅡ血糖儀和血糖試紙測定血糖水平；微柱法測定糖化血紅蛋白濃度；酶學法測定甘油三酯和總膽固醇的含量；Mallory三色染色檢測心肌組織內膠原纖維含量的變化；雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清TNF-α的動態變化，免疫組化檢測各組心肌組織TNF-α的表達。結果與對照組比較，模型組大鼠糖脂代謝紊亂，心臟功能明顯下降(P<0.01)，心肌組織異常膠原纖維大量堆積，血液及心肌組織中TNF-α的表達顯著升高(P<0.01)。胰島素與硒合用比單用胰島素治療更能明顯改善糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，減輕心肌膠原網絡重構，抑制血液及心肌組織中TNF-α的表達(P<0.01)，改善心臟的結構與功能。結論胰島素與硒合用對糖尿病心肌病大鼠心肌重構有明顯的改善作用，其對TNF-α表達的抑制可能是其作用的分子機制之一。

胰島素； 亞硒酸鈉； 糖尿病； 心肌重構； 腫瘤壞死因子

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的主要并發癥之一，具有極高的病死率和致殘率[1]，其病理生理特點為左心室舒張功能障礙，晚期也有收縮功能的降低。心肌膠原網絡重構和心肌間質纖維化是左心室舒張和收縮功能障礙的主要病理基礎[2]。對糖尿病的有效治療是控制心功能惡化的關鍵。胰島素的降糖效果迅速且明顯，但長期大量使用療效降低，并引起低血糖、冠心病等副作用。因此，研制新的組方藥物可能會為糖尿病的防治及胰島素的應用展現嶄新的前景。本研究室前期的實驗結果已經證明，胰島素與硒合用能明顯降低糖尿病大鼠的血糖及血脂，改善心肌的能量代謝障礙,說明胰島素與硒合用存在可行性，并摸索出兩藥的合理配比劑量是1 U·kg-1∶180 μg·kg-1[3]。但胰島素與硒聯合用藥對于糖尿病心肌病所致的心肌重構是否具有防治作用尚不明確，本實驗旨在闡明兩藥聯合對糖尿病心肌病大鼠心肌重構的作用，并初步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1主要儀器和試劑

清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～200 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(陜)2010-0006。分籠飼養，房間溫度保持在25 ℃左右，濕度在50%左右。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和亞硒酸鈉購自Sigma，中效胰島素購自西安交通大學第一附屬醫院(諾和靈公司)。血糖儀和血糖試紙(強生公司)；SABC 免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒購于博士德公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

2糖尿病心肌病大鼠造模及分組

SD大鼠38只，隨機選8只作為正常對照組(control)，其余30只為模型組。模型組采用一次性腹腔注射STZ 50 mg·kg-1復制大鼠糖尿病模型，1 周后于大鼠尾尖采血，血糖儀測定血糖，并測尿糖。血糖>16.7 mmol·L-1、尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型誘導成功。30只誘導成功的大鼠隨機分為3組，每組10只。(1)糖尿病心肌病模型組(DCM)：自由飲食和進水；(2)胰島素(insulin,Ins)干預組(DCM+Ins)：皮下注射胰島素1 U·kg-1·d-1；(3)胰島素與亞硒酸鈉聯合干預組(DCM+Ins+Se)：皮下注射胰島素1 U·kg-1·d-1，同時管飼亞硒酸鈉180 μg·kg-1·d-1。正常對照組腹腔注射生理鹽水，以上各組均以普通飼料持續喂養12周[4]。

3生化指標測定

各組大鼠喂養12周后，處死前腹主動脈采血檢測血糖、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)和血脂。采用One TouchⅡ血糖儀和血糖試紙測定血糖水平；微柱法測定HbA1c濃度；酶學法測定甘油三酯 (triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量。

4血清TNF-α表達的動態監測

各組分別于第2、4、6、8、10、12周，空腹12 h后，采用尾部采血2 mL，注入試管中，待凝固后分離血清，低溫冷凍離心(3 000 r·min-1，4 ℃) 15 min。雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測TNF-α，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

5大鼠心臟功能檢測

各組大鼠處死之前，先監測血流動力學。動物麻醉后分離右側頸總動脈，將內徑約為1 mm的PE-50聚乙烯導管逆行插入左心室，當血壓波變為具有明顯舒張期而且峰頂平坦的波形時，表明導管已經進入心室。穩定20 min后，記錄左室收縮末壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

6心肌組織膠原纖維的Mallory染色及定量分析

處死動物后，迅速開胸，摘取心臟，用預冷的生理鹽水沖洗心腔中的血塊，剪除心臟周圍結締組織和血管，濾紙吸干水分，取左室心肌組織，按Mallory原法固定，處理包埋，切片脫蠟至水，結果使膠原纖維呈藍色，細胞核深紅色，胞漿紅色。采用DT2000型圖像分析軟件2.0進行拍照和分析，測量心肌膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)，CVF=心肌膠原面積/所測視野總面積，所有標本隨機取8個視野測量，取平均值。

7免疫組化檢測心肌組織TNF-α的表達

取心肌組織，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片；3% H2O2室溫孵育10 min，正常山羊血清封閉20 min；滴加1∶500 TNF-α抗體，37 ℃孵育1 h，緩沖液清洗；滴加生物素標記的Ⅱ抗，37 ℃ 孵育20 min；PBS洗3次，滴加SABC 37 ℃ 孵育20 min；DAB顯色，PBS清洗；蘇木素輕度復染，乙醇脫水，中性樹膠封片。

8統計學處理

采用SPSS 13.0 統計軟件處理數據，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1動物一般情況

模型組多食、多飲、多尿，體質量明顯減輕，血糖水平升高，符合糖尿病的診斷標準；藥物干預各組按實驗設計給予藥物，各組動物均以普通飼料喂養12周后，模型組死亡2只，藥物干預組各死亡1只，尸檢結果表明死于感染及糖尿病并發癥。對照組為8只。

2胰島素與硒聯合應用對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

與對照組比較，模型組及藥物干預組血糖、HbAIc、TC和TG水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，胰島素單用組及胰島素與硒聯合用藥組的血糖、HbA1c、TC和TG水平均明顯降低(P<0.01)；與胰島素單用組相比，聯合用藥組各指標下降更為明顯(P<0.01)。表明胰島素與硒聯合用藥對改善糖尿病大鼠的糖脂代謝更為顯著，見表1。

表1胰島素與硒聯合用藥對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

Table 1. Effects of combination of insulin(Ins,1 U·kg-1) and selenium(Se,180 μg·kg-1) on blood glucose and blood lipid in DCM rats(Mean±SD)

GroupnBG(mmol·L-1)HbA1c(%)TC(mmol/L)TG(mmol/L)Control85.42±0.705.17±0.641.62±0.140.73±0.08DCM821.46±3.76△△8.98±1.02△△2.98±0.24△△1.83±0.09△△DCM+Ins915.48±1.74△△**7.02±0.45△△**2.90±1.89△△1.51±0.07△△**DCM+Ins+Se99.03±1.08△△**##5.85±0.33**##2.22±0.23△△**##1.10±0.15△△**##

△△P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

3各組動物心功能參數比較

由表2可見，與對照組比較，模型組及藥物干預組+dp/dtmax明顯增大(P<0.01)，LVSP、LVEDP和-dp/dtmax明顯減小(P<0.01)。說明經STZ誘導12周后，心臟收縮及舒張功能均有不同程度的下降，與對照組比較，模型組心功能降低最為明顯(P<0.01)，從心功能方面提示了動物模型的制備比較成功；與模型組比較，藥物干預各組心臟功能明顯改善(P<0.01)，但與胰島素給藥組比較，胰島素與硒合用組心功能的改善更為明顯(P<0.01)。

表2 各組心功能參數的比較

△△P<0.01vscontrol group；*P<0.05，**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

4心肌膠原纖維Mallory染色

正常對照組心肌纖維呈束狀分布，排列整齊、致密，斷裂不明顯，膠原纖維堆積少。模型組心肌纖維呈現進行性排列紊亂、增粗，肌纖維間隙明顯增寬，并可見大量異常膠原纖維堆積。胰島素單獨給藥組及聯合用藥組心肌纖維排列紊亂、增粗及間隙增寬等現象均明顯減輕，異常膠原纖維堆積均顯著減少，但聯合用藥組比單用胰島素治療改善更明顯,見圖1。這說明胰島素與硒聯合應用治療糖尿病能明顯改善心肌膠原網絡重構。

Figure 1. Mallory staining of myocardium collagen fiber in rats (×400). A:control； B: DCM； C: DCM+Ins； D: DCM+Ins+Se.

圖1心肌膠原纖維Mallory染色

5大鼠心肌膠原纖維定量分析

與對照組比較，模型組及藥物干預各組CVF均增高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物干預各組CVF均不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與胰島素單獨給藥組比較，胰島素與硒聯合應用組CVF降低更加明顯(P<0.01),提示聯合用藥能明顯減少心肌膠原纖維堆積,見圖2。

Figure 2. Comparison of collagen volume fraction in myocardium among groups.Mean±SD.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

圖2各組心肌膠原纖維容積分數的比較

6各組大鼠血清TNF-α的動態變化

由圖3可見，模型組大鼠血清TNF-α濃度呈時間依賴性升高，明顯高于其它組，提示糖尿病大鼠TNF-α在血清中的濃度隨著病變程度的加重而升高。藥物干預后TNF-α均有明顯下降，但依然高于正常水平。然而胰島素與硒聯合用藥TNF-α濃度的下降較單用胰島素組更為顯著。

Figure 3. Dynamic changes of TNF-α in serum of rats in each group. Mean±SD.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM;△△P<0.01vsDCM+Ins.

圖3各組大鼠血清TNF-α的動態變化

7心肌組織中TNF-α表達

鏡下可見，TNF-α表達部位主要在心肌間質及成纖維細胞胞漿，其胞核內和心肌細胞內較少，陽性結果為胞漿出現不同濃度的棕黃色顆粒。與正常對照組比較，模型組心肌間質及成纖維細胞胞漿TNF-α染色明顯增強；藥物干預各組染色均比模型組減弱，但胰島素與硒聯合用藥TNF-α染色減弱比單用胰島素組更明顯，見圖4。

Figure 4. Immunohistochemical staining of TNF-α in the myocardium of rats (×400).A: control; B: DCM; C: DCM+Ins; D: DCM+Ins+Se.

圖4免疫組化檢測大鼠心肌組織TNF-α表達

討 論

心肌膠原網絡重構和間質纖維化是糖尿病心肌病的特征性病理改變，最終將導致心室收縮及舒張功能障礙，誘發心力衰竭[5]。糖代謝紊亂是加速糖尿病心肌病發生發展的重要原因，高血糖作為獨立的危險因素，直接引起心肌損害而導致心臟功能惡化。因此，安全而有效地控制高血糖對治療糖尿病心肌病具有十分重要的意義。硒是人體必須的微量元素，其缺乏將會導致腫瘤和心血管疾病的產生。將胰島素與硒聯合應用是基于硒的抗氧化作用及類胰島素樣作用[6-7]。硒的類胰島素樣作用已經在糖利用[8]和糖代謝[9]方面得到了證實。Ghosh等[10]的研究也表明，糖尿病大鼠經硒治療后，胰島素水平明顯升高。因此胰島素與硒聯合應用應該優于單用胰島素治療。前期的研究結果已證明，將胰島素與硒合用治療糖尿病，明顯改善了糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，為延緩并防治心肌損傷提供了條件[3]。

本實驗采用STZ成功誘導糖尿病大鼠心肌重構動物模型，12 周后通過心功能指標檢測，模型組有明顯的心臟舒縮功能障礙，Mallory染色顯示心肌纖維排列紊亂、增粗及間隙增寬，異常膠原纖維堆積增多，表明長期的糖脂代謝異常必將導致心臟結構破壞及功能的惡化。胰島素與硒聯合用藥比單獨應用胰島素治療更能顯著改善心臟的結構及功能。

研究表明，炎癥在糖尿病心肌重構過程中起著十分重要的作用[11]。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，在正常血清及心肌組織表達較少，但在病理因素的刺激下，TNF-α分泌增加，參與心肌重構[12-13]。本實驗結果表明，模型組從第2周開始血清中的TNF-α持續高表達，第12周檢測結果顯示血清及心肌組織TNF-α的表達均明顯高于對照組。胰島素與硒合用比單獨應用胰島素治療更能有效抑制血液及心肌組織中TNF-α的表達，減輕心肌重構的程度，改善心功能。

總之，本研究結果表明：胰島素與硒合用比單獨使用胰島素治療更能有效改善糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，減輕心肌膠原網絡重構，改善心臟的結構與功能，拮抗單用胰島素治療易引起冠心病的風險，其作用機制可能與抑制TNF-α的表達有關。本實驗兩藥合用和單用胰島素時胰島素的劑量一致，故合用時減少胰島素劑量能否達到同樣的效果，尚有待進一步研究。此外，胰島素與硒聯合用藥對糖尿病大鼠心肌保護作用的詳細分子機制及其信號轉導亦有待后續實驗的進一步闡明。

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Effectofinsulincombinedwithseleniumonmyocardialremodelingindiabeticrats

XU Tian-jiao1, ZENG Ju-rong1, XU Xiao-li1, CHEN Lin2, MI Man1, WEI Ming1, LI Ping1

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofPathology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China.E-mail:jrzeng988@163.com)

AIM: To investigate the effects of insulin combined with selenium on myocardial remodeling in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats.METHODSThe animal model of diabetic cardiomyopathy was induced by intraperitoneal injection of STZ (50 mg/kg) in rats. The level of blood glucose was estimated using One Touch SureStep blood glucose meter. Hemoglobin A1c level was detected by microcolumn assay. Triglyceride and total cholesterol were measured by enzymatic method. Collagen content in the myocardium was determined by Mallory staining. The expression of tumor necrosis factor α (TNF-α) in the serum and myocardium was observed by the methods of ELISA and immunohistochemistry, respectively.RESULTSCompared with control group, the animals in model group showed metabolic disorders of glucose and lipid, and the cardiac function declined significantly (P<0.01).The myocardial cells showed disorder of distribution, filament breakage and collagen hyperplasia,and serum and myocardial TNF-α levels were significantly elevated.Insulin in combination with selenium significantly decreased the levels of blood glucose and lipid, and markedly inhibited the expression of TNF-α in the serum and myocardium than those in the rats administered with insulin alone (P<0.01).CONCLUSIONCombination of insulin and selenium significantly improves the structure and function of the heart by down-regulation of TNF-α.

Insulin; Sodium selenite; Diabetes mellitus; Myocardial remodeling; Tumor necrosis factor

R963

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.006

1000- 4718(2013)06- 0993- 05

2012- 12- 10

2013- 04- 10

陜西省教育廳自然科學研究計劃(No. 12JK0710)

△通訊作者 Tel: 029-86177562; E-mail: jrzeng988@163.com