Gab2 在SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突變所致小鼠髓系異常增殖中的作用*

陳 吉， 汪心怡， 陳 卓， 李菲菲， 鄭 紅， 瞿成奎,2， 汪思應

(1安徽醫科大學病理生理教研室，安徽 合肥 230032； 2Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio 44106 USA)

Gab2 在SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突變所致小鼠髓系異常增殖中的作用*

陳 吉1， 汪心怡1， 陳 卓1， 李菲菲1， 鄭 紅1， 瞿成奎1,2， 汪思應1

(1安徽醫科大學病理生理教研室，安徽 合肥 230032；2Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio 44106 USA)

目的觀察SHP-2信號通路中關鍵接頭蛋白Gab2對SHP-2激活突變引發的小鼠髓系異常增殖是否具有調控作用。方法用Gab2-/-和SHP-2D61G/+模型小鼠建立4種基因型(SHP-2+/+、Gab2-/-、SHP-2D61G/+和SHP-2D61G/+/Gab2-/-)小鼠，解剖分析其脾大小，外周血白細胞計數，流式細胞術檢測外周血及骨髓髓系細胞表面標志分子Mac-1和Gr-1并計數Mac-1和Gr-1陽性髓系細胞比例，骨髓造血干/祖細胞集落形成實驗檢測小鼠造血干細胞或祖細胞對細胞因子反應性，Western blotting和免疫沉淀實驗檢測骨髓來源肥大細胞經IL-3刺激后磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)和磷酸化胞外信號調節激酶(p-ERK)的活化水平，以及Gab2與SHP-2蛋白的結合情況。結果敲除Gab2后顯著減輕SHP-2激活突變導致的小鼠髓系增殖表型，主要表現在：脾指數減小，外周血白細胞減少，小鼠髓系來源的Mac-1和Gr-1陽性細胞比例降低。與SHP-2D61G/+小鼠相比，經IL-3刺激后，骨髓細胞的集落形成能力顯著降低；骨髓來源肥大細胞內p-ERK和p-Akt表達明顯下調，SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠肥大細胞內無Gab2與SHP-2結合。結論敲除Gab2可以明顯減輕SHP-2D61G/+激活突變導致的小鼠髓系異常增殖，這種減輕作用可能與SHP-2無法與Gab2結合而導致下游信號途徑ERK和Akt活化減弱有關。

SHP-2酪氨酸磷酸酶； 基因激活突變； Gab2； 髓系增殖性疾病

髓系增殖性疾病(myeloproliferative disorders, MPD)屬骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome, MDS)范疇，系干細胞來源的克隆性疾病。形態學觀察可見病態造血現象，其特點是骨髓有核細胞增多，增殖的細胞可向終末分化成熟，多不伴發育異常；外周血紅細胞、白細胞、血小板增多，可伴有肝脾腫大，后期出現骨髓纖維化、骨髓衰竭及轉化為急性白血病。最終因MDS期骨髓衰竭伴隨并發癥或到達白血病期而難以治療。為此MDS 也被稱為白血病前期[1]。在修訂的2008年WHO分類系統中，MPD改稱為骨髓增殖腫瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)，并強調了這類疾病的本質是腫瘤[1-3]。

MPD的發病機制不清，研究認為，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)信號轉導途徑過度活化是MPN重要的發病機制。同時也發現，PTKs信號通路負性調控基因PTPN11激活突變可能與其有關[4]。PTPN11編碼的蛋白SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)家族成員之一，廣泛表達于機體各組織細胞中，參與調節包括 Ras-ERK 在內的多條信號通路[5-7]，與細胞的存活、遷移、黏附、細胞骨架形成等關系密切[8-9]。作為一種酪氨酸磷酸酶，SHP-2通過將與其結合的信號轉導分子去磷酸化，從而阻斷局部信號轉導。但是，SHP-2在大部分信號通路中卻是起到增強信號轉導的作用。研究發現，SHP-2在造血細胞中高表達，對造血細胞的發育、分化起正調控作用，促進血細胞的增殖和分化[6,9]。此外，SHP-2在IL-3介導的造血細胞信號轉導中除了起磷酸酶催化活性依賴的作用外，其還發揮了催化活性非依賴的接頭蛋白功能[9-10]。2001年以來，SHP-2激活突變體在Noonan綜合征(伴MPD)、MPD、幼年型粒單細胞白血病及其它白血病和一些實體瘤中陸續發現[11-14]，提示SHP-2與白血病的發生密切相關。為了更好地研究SHP-2突變體引發疾病的機制，Neel實驗室建立了SHP-2D61G/+基因敲入小鼠模型，在該模型小鼠中并沒有發現白血病，但出現Noonan綜合癥和MPD表型[6,15-16]。

本課題組前期運用SHP-2D61G/+模型小鼠，觀察SHP-2激活突變對小鼠髓系增殖及相關信號通路的影響,發現SHP-2D61G/+小鼠出現明顯的髓系異常增殖，并且可能與Ras-ERK及 PI3K-Akt的活化有關[17]。進一步研究發現，SHP-2D61G/+小鼠分離得到的肥大細胞對IL-3反應性增高，可能由于在此過程中SHP-2發揮接頭蛋白的功能，激活突變的SHP-2與Gab2結合增多所致[6,17-18]。

Gab2蛋白是SHP-2介導的信號通路中關鍵的接頭蛋白，它屬于Gab蛋白家族的一員，其結構中缺乏酶活性結構域，可以通過其自身的PH結構域、脯氨酸富集區及多個酪氨酸位點與其它信號分子結合，參與多種細胞信號調控，在細胞增殖、分化、凋亡及遷移等生理過程中發揮重要作用。目前認為，Gab2激活后主要通過下游的 Ras-ERK及 PI3K-Akt 等途徑傳遞信號[19]。Gab2 結構中包含2個 SHP-2的綁定位點，是SHP-2重要的結合分子[18-21]。

由此設想，在SHP-2激活突變導致的髓系異常增殖過程中，減少Gab2的作用是否可以降低MPD的發生。為此，我們運用SHP-2D61G/+及Gab2-/-模型小鼠，建立SHP-2+/+、Gab2-/-、SHP-2D61G/+和SHP-2D61G/+/Gab2-/-4種基因型小鼠，探尋敲除Gab2對SHP-2激活突變導致的髓系異常增殖有無影響及其機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥品與試劑 生理鹽水購于北京雙鶴藥業，RPMI-1640培養基和胎牛血清購于Gibco，FITC標記的Mac-1和Gr-1抗體購于北京博奧森生物公司，Western blotting 所用ERK、Akt、p-ERK、p-Akt、SHP-2、p-Tyr、Gab2等抗體及 protein A/G瓊脂糖珠均購于Santa Cruz。

1.2動物 C57BL/6品系SHP-2D61G/+及Gab2-/-小鼠由美國Case Western Reserve大學瞿成奎教授提供。用Gab2-/-和SHP-2D61G/+小鼠雜交，鑒定出雌雄SHP-2D61G/+/Gab2+/-小鼠作為種鼠雜交，生產并鑒定出本實驗所需的4種基因型小鼠，分別為：SHP-2+/+、Gab2-/-、SHP-2D61G/+和SHP-2D61G/+/Gab2-/-。取10周齡小鼠配對備用。

2方法

2.1脾指數的測定 小鼠頸椎脫臼處死，稱取體重(g)，分離脾臟稱重(mg)，計算脾指數=脾重(mg)/體重(g)。

2.2外周血白細胞(white blood cell ,WBC)計數 小鼠摘取眼球取血約300 μL于2% EDTA-K2抗凝劑的采血管中，紅細胞破壞法(3%乙酸溶液∶血液=19∶1)獲得白細胞，應用F2800微細胞儀計數小鼠白細胞。

2.3骨髓細胞的分離 處死小鼠，無菌分離雙側股骨和脛骨并剪去骨端，用3 mL RPMI-1640培養液沖洗骨髓3次，收集沖洗液，吹打混勻成單細胞懸液，用白細胞稀釋液稀釋，作骨髓有核細胞計數后備用。

2.4流式細胞術檢測骨髓細胞表面標記 骨髓細胞離心洗滌后，用含2% BSA的PBS制備成細胞懸液，加2 ng Fc受體阻斷抗體，室溫孵育15 min，離心洗滌1次，每管加入細胞1×106個，體積為100 μL，分別加FITC標記的相關抗體(Mac-1和Gr-1)，冰浴30 min，加3 mL預冷PBS后，離心洗滌，每管加500 μL PBS(1% BSA)重懸細胞，流式細胞儀檢測分析。

2.5骨髓細胞集落形成檢測 骨髓細胞建立后，按2×107/L接種于含造血細胞生長因子IL-3的甲基纖維素半固體培養基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱內進行培養。培養7 d后在倒置顯微鏡下觀察集落形成，并分別計數骨髓細胞的集落數(≥50個細胞組成的細胞團)。

2.6骨髓中單個核細胞的分離 用來分離骨髓單個核細胞的分層液比重是1.120±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液。離心后，紅細胞、粒細胞比重大，沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于分層液比重，漂浮于分層液的上方，也可有少部分細胞懸浮于分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可以從骨髓中分離到單個核細胞，主要包括淋巴細胞和單核細胞。將細胞置于另一短管中，加入5倍體積的Hanks液，離心洗滌細胞2次，棄上清，加入含有10% FBS和0.5 μg/L IL-3的RPMI-1640培養液，重懸細胞，常規培養。

2.7肥大細胞的獲取和培養 骨髓細胞分離后，用含10% FBS和0.5 μg/L IL-3的RPMI-1640培養液，細胞按1.0×109/L接種于培養皿，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱內進行培養，48 h后貼壁生長細胞為巨噬細胞，吸取懸浮細胞于另一培養皿中。每72 h更換培養基，每周更換培養皿，同樣條件下培養2周后即為肥大細胞。

2.8Western blotting檢測信號分子ERK及Akt的活化情況 取4組指數生長期的肥大細胞，饑餓培養6 h后，用2.0 μg/L IL-3刺激0、5和15 min，提總蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，分別加入p-ERK、p-Akt、Akt和ERK抗體 (4 ℃孵育過夜)及相應經辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗 (常溫孵育1 h)，用ECL系統進行檢測。

2.9免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)檢測Gab2與SHP-2的結合情況 取4組指數生長期的肥大細胞，饑餓培養6 h后，用2.0 μg/L IL-3刺激0、5和15 min，預冷PBS洗滌，加入 IP裂解液緩沖液裂解1 h,離心取上清，加入protein A/G agarose,翻轉混勻預吸附，離心取上清。按實驗需要加入不同Ⅰ抗(SHP-2、Gab2和p-Tyr)，翻轉混勻，最后加入protein A/G agarose 20 μL，4 ℃翻轉孵育過夜。洗滌，沉淀后加上樣緩沖液，100 ℃，煮沸10 min。離心取上清，20 μL上樣于15% SDS-PAGE進行Western blotting檢測。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 13.0統計軟件對數據進行方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1Gab2敲除后，由SHP-2突變導致的小鼠脾臟增大表型明顯改善

與SHP-2+/+小鼠相比，Gab2敲除小鼠脾臟大小沒有明顯差異，而SHP-2D61G/+小鼠脾臟明顯增大；在SHP-2D61G/+小鼠中敲除Gab2后，SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠脾指數明顯低于SHP-2D61G/+小鼠(P<0.05)，見圖1,提示Gab2敲除能減輕SHP-2突變導致的小鼠脾臟增大。

Figure 1. The spleen index ofSHP-2D61G/+/Gab2-/-mice obviously decreased, compared withSHP-2D61G/+mice. Mean±SD.**P<0.01vsSHP-2+/+;△P<0.05vsGab2-/-.

圖1Gab2敲除后，SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠脾指數比SHP-2D61G/+小鼠明顯下降

2敲除Gab2降低SHP-2突變導致的小鼠異常增加的外周血白細胞

4組小鼠外周血白細胞計數結果顯示，與SHP-2+/+小鼠相比，Gab2敲除小鼠外周血白細胞數沒有明顯變化，SHP-2D61G/+小鼠外周血白細胞數明顯增加，而SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠白細胞數明顯低于SHP-2D61G/+小鼠(P<0.05)，見圖2，提示Gab2敲除能降低SHP-2突變導致的小鼠外周血白細胞異常增加。

3敲除Gab2降低SHP-2突變小鼠骨髓細胞中髓系比例

Gab2敲除后，SHP-2激活突變導致外周血白細胞以及骨髓細胞中髓系異常增加的現象均得到改善。圖3顯示SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠骨髓Mac-1和Gr-1陽性細胞比例明顯低于SHP-2D61G/+組小鼠(外周血結果相同，未列出)。

Figure 2.Gab2 knockout reduced the number of peripheral white blood cells that increased by theSHP-2D61G/+mutation. Mean±SD.**P<0.01vsSHP-2+/+;△P<0.05vsGab2-/-.

圖2敲除Gab2降低SHP-2D61G/+突變導致的外周血白細胞異常增高

Figure 3. The proportion of Mac-1 and Gr-1 positive cells obviously decreased in the bone marrow (BM) cells ofSHP-2D61G/+/Gab2-/-mice. Mean±SD.**P<0.01vsSHP-2+/+;△P<0.05vsGab2-/-.

圖3SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠骨髓細胞Mac-1和Gr-1陽性比例明顯低于SHP-2D61G/+小鼠

4SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠骨髓細胞對IL-3的反應性降低

在甲基纖維素半固體培養系統中，用不同濃度IL-3 (0、0.2、2和10 μg/L)培養骨髓細胞，可以刺激骨髓造血祖細胞或干細胞向髓系分化增殖并形成集落。如圖4所示，經IL-3刺激后，Gab2敲除小鼠骨髓細胞對IL-3的反應性降低，集落形成小而少；SHP-2D61G/+/Gab-2-/-小鼠來源的骨髓細胞集落形成能力明顯低于SHP-2D61G/+單一突變的小鼠骨髓細胞，在IL-3濃度為2 μg/L時尤為顯著。

Figure 4.Gab2 knockout reduced the hypersensitivity of myeloid progenitor cells inSHP-2D61G/+mutation mice induced by IL-3. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vsSHP-2+/+.

圖4與SHP-2D61G/+小鼠相比，SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠骨髓細胞對IL-3的反應性降低

5Gab2基因敲除后，SHP-2D61G/+蛋白無法與Gab2蛋白結合從而阻斷下游信號途徑活化

SHP-2在細胞信號調控過程中可以和Gab2結合，對MAPK及PI3K信號途徑活化起重要作用。 實驗發現,SHP-2激活突變的細胞在IL-3刺激下，SHP-2與Gab2結合增加，磷酸化ERK和Akt水平增高；Gab2敲除阻斷了SHP-2D61G/+與Gab2結合，與SHP-2D61G/+小鼠相比，SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠的肥大細胞在IL-3刺激下，ERK和Akt磷酸化水平降低,見圖5、6。

討 論

我們前期研究發現SHP-2D61G/+模型小鼠出現明顯的髓系增殖現象，主要表現在：脾臟明顯增大，外周血白細胞增多，且外周血和骨髓細胞中髓系細胞比例明顯升高，其機制可能與SHP-2激活突變后導致的與細胞增殖密切相關的MAPK及PI3K信號途徑異常活化有關[17-18]。 但SHP-2是酪氨酸磷酸酶，其激活突變引起的磷酸酶活性升高理論上應該導致細胞內酪氨酸磷酸化蛋白水平降低，多種細胞信號活性可能會受到抑制。為何在SHP-2D61G/+細胞內出現下游信號的增強呢，這可能與SHP-2還具有接頭蛋白功能有關。 激活突變的SHP-2可以結合更多的Gab2，進而活化Ras-ERK和PI3K-Akt信號通路[6,17-18]。我們設想，除了抑制激活突變SHP-2的功能外，抑制Gab2的功能有可能減輕SHP-2激活突變導致的髓系異常增殖。為此，我們建立了SHP-2+/+、Gab2-/-、SHP-2D61G/+和SHP-2D61G/+/Gab2-/-4種基因型小鼠，觀察模型小鼠髓系增殖情況，果然發現SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠無論是脾臟增大、外周血白細胞增多及髓系細胞比例都較SHP-2D61G/+小鼠明顯改善，Gab2缺失使SHP-2激活突變的骨髓細胞對IL-3反應性也明顯降低。IP結果證實，Gab2缺失阻斷了骨髓來源的肥大細胞(經IL-3刺激)內SHP-2與Gab2的結合，且ERK和Akt 的活化也明顯減弱。這些結果表明，當SHP-2與Gab2的結合被阻斷后，SHP-2激活突變導致的小鼠髓系異常增殖現象明顯減輕，并且ERK和Akt的磷酸化水平也顯著降低。這提示在SHP-2激活突變導致的小鼠髓系異常增殖過程中Gab2起到關鍵的接頭蛋白作用，這種作用可能還會參與SHP-2激活突變相關腫瘤的發生與發展。本研究結果揭示了SHP-2激活突變導致髓系增殖等疾病的分子機制，也為SHP-2激活突變相關白血病的治療提供一個潛在的作用靶點。

Figure 5. The binding capacity of SHP-2D61G/+with Gab2.

圖5SHP-2D61G/+蛋白能與Gab2蛋白結合

Figure 6.Gab2 knockout reduced the phosphorylation levels of ERK and Akt inSHP-2D61G/+mast cells.

圖6Gab2敲除后，SHP-2突變導致的ERK和Akt活化減弱

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RoleofGab2inmousemyeloidabnormalproliferationinducedbySHP-2D61G/+mutation

CHEN Ji1, WANG Xin-yi1, CHEN Zhuo1, LI Fei-fei1, ZHENG Hong1, QU Cheng-kui1, 2, WANG Si-ying1

(1DepartmentofPathophysiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2CaseWesternReserveUniversity,Cleveland,Ohio44106,USA.E-mail:sywang@ahmu.edu.cn)

AIM: To investigate whether Gab2, the key adapter protein in the SHP-2 signaling pathway, is involved in mouse myeloid abnormal proliferation induced bySHP-2D61G/+mutation.METHODSFour kinds of mouse model genotyped asSHP-2+/+,Gab2-/-,SHP-2D61G/+andSHP-2D61G/+/Gab2-/-were generated from crossbreeding ofGab2-/-mice andSHP-2D61G/+mice. The mouse spleen size was analyzed. The number of peripheral blood leukocytes was counted by cell counting and the percentage of Mac-1 or Gr-1 positive myeloid cells in the bone marrow was detected by flow cytometry. The proliferation ability of bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells in response to cytokines was assayed by colony formation. The expression of p-ERK and p-Akt and the binding capacity of SHP-2 with Gab2 in the bone marrow-derived mast cells stimulated with IL-3 were detected by Western blotting and immunoprecipitation.RESULTSThe phenotype of myeloproliferative disorder, such as enlarged spleen size, increased leukocyte number and high percentage of myeloid cells, inSHP-2D61G/+mutant mice was found, and was dramatically improved inSHP-2D61G/+/Gab2-/-double mutation mice. Furthermore, compared withSHP-2D61G/+mutation mice, significantly decreased colony formation ability of the bone marrow cells with IL-3 stimulation was observed inSHP-2D61G/+/Gab2-/-double mutation mice. A reduced phosphorylation level of ERK/Akt, and SHP-2 without binding of Gab2 were found inSHP-2D61G/+/Gab2-/-bone marrow-derived mast cells with IL-3 stimulation.CONCLUSIONGab2 knockout significantly reduces mouse myeloid abnormal proliferation induced bySHP-2D61G/+mutation. The molecular mechanism may be associated with reduced binding ofSHP-2D61G/+underGab2 knockout, and further weakened the activation of downstream signaling pathways of ERK and Akt.

SHP-2 tyrosine phosphatase; Genetic gain-of-function mutation; Gab2; Myeloproliferative disorders

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.008

1000- 4718(2013)06- 1003- 06

2012- 12- 28

2013- 04- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 30873046; No.30973424; No.81272258)； 教育部博士點基金資助項目(No. 200803660005)；安徽省出國留學回國人員科技項目(N0. 2009-2011)

△通訊作者 Tel: 0551-65137833; E-mail: sywang@ahmu.edu.cn