EGFR-p38 MAPK信號通路參與機械通氣肺損傷大鼠肺組織HMGB1的表達*

唐春林， 丁 寧， 程傲冰

(1廣州醫學院附屬腫瘤醫院麻醉科，廣東 廣州 510095； 2廣州市第一人民醫院麻醉科，廣東 廣州 510180)

EGFR-p38 MAPK信號通路參與機械通氣肺損傷大鼠肺組織HMGB1的表達*

唐春林1， 丁 寧2△， 程傲冰2

(1廣州醫學院附屬腫瘤醫院麻醉科，廣東 廣州 510095；2廣州市第一人民醫院麻醉科，廣東 廣州 510180)

目的研究表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)-p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路在機械通氣肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)大鼠肺組織高遷移率族盒蛋白1 (high mobility group box 1 protein, HMGB1)表達中的作用。方法健康SD大鼠32只隨機分為4組：對照組(A組)不行機械通氣，保留自主呼吸；小潮氣量通氣組(B組)潮氣量(VT)為8 mL/kg；大潮氣量通氣組(C組)VT為40 mL/kg；大潮氣量通氣+EGFR拮抗劑AG-1478組為D組。機械通氣4 h后處死動物，測定支氣管肺泡灌洗液中總蛋白水平、白細胞計數以及肺濕干重比值(W/D)和髓過氧化物酶(MPO)活性，采用HE染色觀察肺組織病理學改變，Western blotting方法檢測肺組織磷酸化EGFR、磷酸化p38和HMGB1蛋白表達，RT-PCR方法檢測EGFR mRNA的表達。結果通氣4 h后，與A組比較，C組肺組織病理學改變明顯，總蛋白水平、白細胞計數、肺W/D、MPO活性、EGFR mRNA表達和磷酸化水平、p38磷酸化水平以及HMGB1蛋白表達均顯著增加(P<0.05)；與C組比較，D組上述各項指標的變化均顯著降低(P<0.05)。結論大潮氣量機械通氣可引起大鼠急性肺損傷，其機制可能與通過EGFR-p38 MAPK信號通路介導HMGB1蛋白的表達有關。

機械通氣； 急性肺損傷； 受體，表皮生長因子； 高遷移率族盒蛋白1； 絲裂原激活蛋白激酶類

機械通氣(mechanical ventilation, MV)在臨床危重癥患者的救治中具有無可替代的作用，更是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)治療的革命性進步。然而，機械通氣亦可作為一種損傷因素誘發或加重肺損傷，即機械通氣所致肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)[1-2]。我們的前期研究表明，“晚期”炎癥介質高遷移率族盒蛋白1(high mobility group box 1 protein, HMGB1)是介導VILI的關鍵性炎癥因子，但其調控機制有待闡明[3-5]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是細胞生長、分化、增殖、遷移和存活的重要調節因子，近年發現，EGFR作為機械傳感器介導了多種類型細胞對機械應激的反應[6-7]。本研究通過復制大鼠VILI模型，探討EGFR-p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路在VILI大鼠肺組織表達HMGB1中的作用，旨在闡明EGFR在VILI中的作用機制，并為VILI提供新的藥物靶位和新的治療途徑。

材 料 和 方 法

1材料

雄性SD大鼠32只，8～12周齡，體重220～280 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。Oligo(dT)12-18、M-MLV逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶(Promega)，RNA提取試劑(Boehringer Mannhein)，PCR引物由上海生物工程公司合成，EGFR拮抗劑AG-1478(Calbiochem)，兔抗鼠EGFR抗體、磷酸化EGFR (p-EGFR)抗體、p38抗體、磷酸化p38 (p-p38)抗體、HMGB1抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(Abcam)，ECL化學發光試劑盒(Amersham)。

2方法

2.1模型復制與分組 32只SD大鼠隨機分為4組，每組8只。A組為對照組，不行機械通氣；B組為小潮氣量通氣組，潮氣量(tidal volume,VT)=8 mL/kg，C組為大潮氣量通氣組，VT=40 mL/kg，D組為大潮氣量通氣+AG-1478組。機械通氣參數設置為呼氣末正壓(positive end-expiratory pressure,PEEP)=0 mmHg，吸呼比1∶1，調節呼吸頻率(RR)使呼氣末二氧化碳分壓(end-tidal carbon oxide partial pressure,PETCO2)維持在35～45 mmHg，通氣時間為4 h。右頸總動脈置管測動脈壓，左股靜脈置管用于輸液和給藥。監測動物血壓、心率、心電圖和PETCO2。機械通氣達到預定時間后，放血處死大鼠。

2.2觀察指標與測定方法

2.2.1肺組織濕/干重比值(W/D) 取大鼠右肺中葉組織，稱濕重(wet weight,W)后于干燥箱中80 ℃烤至恒重并稱干重(dry weight,D)，計算肺W/D。

2.2.2支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fiuid,BALF)中白細胞(white blood cell,WBC)計數和總蛋白含量測定 左肺行肺灌洗，回收后800 r/min離心10 min，沉淀物用PBS稀釋后行瑞氏染色，光鏡下行白細胞計數。BALF中總蛋白的測定采用考馬斯亮藍染色法。

2.2.3肺組織髓過氧化酶(myeloperoxidase,MPO)活性測定 肺組織MPO活性測定采用MPO ELISA試劑盒(Hycult Biotech)。

2.2.4EGFR mRNA表達的測定 按Trizol一步法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。取逆轉錄產物進行PCR反應(94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環)。EGFR的擴增引物為5’-CCG TAA CGA TAC AGT ACA TAC CAC TGA -3’，5’-TCT AAT TGG TCC CAT CCA TTC AAT ATT ACA-3’；內參照GAPDH的擴增引物為5’-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GA-3’，5’-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3’。2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(Kodak)采集圖像并進行半定量分析，以EGFR/GAPDH灰度比值表示各組EGFR mRNA的水平，各組實驗重復3次。

2.2.5EGFR、p38活性和HMGB1蛋白水平的測定 肺組織加入細胞裂解液后冰上勻漿，蛋白質定量采用Bradford法，樣品加入2×SDS加樣緩沖液，行SDS-PAGE凝膠分離，蛋白條帶半干電轉移到PVDF膜上。室溫下用TTBS(100 mmol/L Tris-HCl，0.9 % NaCl，0.1 % 吐溫-20)阻斷1 h，先后分別用p-EGFR、p38、p-p38、HMGB1 Ⅰ抗和IgG-HRP Ⅱ抗孵育，最后用增強化學發光法檢測陽性信號。采集圖像并進行半定量分析，以p-EGFR/β-actin、HMGB1/β-actin以及p-p38/p38的灰度比值表示各組蛋白表達水平，各組實驗重復3次。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 13.0軟件處理。采用單因素方差分析進行不同組別間的比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1肺組織病理學改變

A組大鼠為正常肺組織，未見明顯的病理學改變；B組大鼠亦未見或僅見輕微的病理學改變；與A組比較，C組大鼠肺組織可見較顯著的炎癥損傷，包括彌漫性肺泡壁增厚和中性粒細胞浸潤等；與C組比較，D組大鼠僅見輕微的上述組織病理學改變，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of the lung tissues in the 4 groups (HE staining, ×200). A: control group; B: small tidal volume ventilation group; C: large tidal volume ventilation group; D: large tidal volume ventilation+AG-1478 group.

圖1各組大鼠肺組織病理學改變

2各組總蛋白、肺W/D、WBC計數和MPO活性的比較

與A組比較，B組總蛋白、肺W/D、WBC計數和MPO活性等指標的變化均無統計學意義(P>0.05)，而C組上述各指標均顯著增加(P<0.05)；與C組比較，D組上述各指標均顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1各組總蛋白、肺W/D、WBC計數和MPO活性的比較

Table 1. Comparison of total protein content, wet/dry weight ratio (W/D), WBC count and MPO activity in the lung tissues among the 4 groups(Mean±SD.n=8)

*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

3肺組織EGFR磷酸化的變化

Western blotting結果顯示，A組EGFR磷酸化水平較低，p-FGFR與β-actin的灰度值比值為0.113±0.022；與A組比較，B組p-EGFR的變化無統計學意義(0.175±0.034，P>0.05)，而C組的p-EGFR水平顯著增加(0.614±0.127，P<0.05)；與C組比較，D組p-EGFR水平顯著降低(0.185±0.036，P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Detection of phosphorylated EGFR in the 4 groups by Western blotting. A: control group; B: small tidal volume ventilation group; C: large tidal volume ventilation group; D: large tidal volume ventilation+AG-1478 group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

圖2Westernblotting檢測各組大鼠肺組織EGFR的磷酸化水平

4肺組織EGFRmRNA表達的變化

RT-PCR結果顯示，A組EGFR mRNA表達水平為0.093±0.019；與A組比較，B組EGFR mRNA的表達變化無統計學意義(0.179±0.059，P>0.05)，而C組的EGFR mRNA表達顯著增加(0.511±0.124，P<0.05)；與C組比較，D組的EGFR mRNA表達水平顯著降低(0.185±0.067，P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of EGFR mRNA in the 4 groups determined by RT-PCR. A: control group; B: small tidal volume ventilation group; C: large tidal volume ventilation group; D: large tidal volume ventilation+AG-1478 group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

圖3RT-PCR檢測各組大鼠肺組織EGFRmRNA的表達

5肺組織p38的活性變化

Western blotting結果顯示，A組的p-p38為0.087±0.023；與A組比較，B組p-p38的變化無統計學意義(0.108±0.033，P>0.05)，而C組的p-p38顯著增加(0.851±0.171，P<0.05)；與C組比較，D組的p-p38水平顯著降低(0.173±0.053，P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The activation of p38 in the 4 groups determined by Western blotting. A: control group; B: small tidal volume ventilation group; C: large tidal volume ventilation group; D: large tidal volume ventilation+AG-1478 group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

圖4Westernblotting檢測各組大鼠肺組織p38的激活情況

6肺組織HMGB1表達的變化

Western blotting結果顯示，A組肺組織HMGB1蛋白表達水平較低(0.129±0.042)，與A組比較，B組HMGB1蛋白表達的變化無統計學意義(0.205±0.084，P>0.05)，而C組的HMGB1蛋白表達顯著增加(0.633±0.132，P<0.05)；與C組比較，D組的HMGB1蛋白表達水平顯著降低(0.182±0.087，P<0.05)，見圖5。

討 論

VILI發生機制復雜，目前尚未完全闡明。近年的研究結果表明，異常的機械力除了可作用于肺組織直接造成機械損傷外，還可以激活肺內效應細胞引起炎癥反應，即“生物傷(biotrauma)”。機械刺激(如牽拉、剪切力)作用于肺泡上皮細胞的壓力感受器和細胞內張力元件，通過機械轉導機制(mechanotransduction)激活細胞內MAPK、NF-κB等信號轉導通路，誘導多種炎癥介質的表達與釋放，進而引起或加重肺損傷[8]。本研究中，大鼠以40 mL/kg的大潮氣量通氣4 h后，反映肺滲出和肺水腫程度的指標肺W/D、總蛋白含量以及反映肺組織白細胞浸潤的MPO活性和白細胞計數均較對照組明顯增加，肺組織病理學觀察亦顯示較為明顯的炎癥改變，提示大鼠發生了急性肺損傷。因此，從細胞和分子生物學基礎來探討機械力學導致和加重肺損傷的炎癥反應機制，使VILI的防治不僅采取適當的保護性通氣策略以減少機械損傷，更要從限制或調整炎癥反應著手，從而避免生物學損傷，這對于改善機械通氣患者的預后具有十分重要的意義。

Figure 5. The expression of HMGB1 protein in the 4 groups determined by Western blotting. A: control group; B: small tidal volume ventilation group; C: large tidal volume ventilation group; D: large tidal volume ventilation+AG-1478 group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

圖5Westernblotting檢測各組大鼠肺組織HMGB1蛋白的表達

EGFR是具有配體介導的酪氨酸激酶活性的多功能跨膜糖蛋白，是定位于人第7號染色體短臂的原癌基因c-erb-B1的表達產物，分子量為170 kD。EGFR是細胞生長、分化、增殖、遷移和存活的重要調節因子，其中一個重要機制是EGFR作為機械傳感器介導了多種類型細胞對機械應激的反應。周期性牽張心肌細胞5 min后即可激活EGFR，并且其磷酸化程度與牽拉強度呈正相關，而應用EGFR抑制劑AG-1478則顯著減弱這種磷酸化激活[9]。EGFR不但在維持正常細胞的功能和存活中非常重要，還與多種疾病的發生發展密切相關，如腫瘤、慢性氣道炎癥疾病和急性肺損傷等。Tschumperlin等[10]在研究哮喘的發病機制時發現EGFR在氣道上皮細胞對損傷性機械力引起的細胞反應中起關鍵性作用。本研究發現，大潮氣量機械通氣(VT=40 mL/kg)可誘導大鼠肺組織EGFR磷酸化激活，表明EGFR參與了VILI的病理生理過程。

作為MAPK信號通路的重要成員之一，p38通路與炎癥和應激反應的調控密切相關[11-12]。本研究顯示，大潮氣量機械通氣時p38發生磷酸化，提示p38信號通路參與了VILI。EGFR抑制劑AG-1478顯著抑制p38磷酸化激活，表明機械牽張通過EGFR引起p38信號通路激活。HMGB1是新近發現的“晚期”炎癥介質，作為關鍵性炎癥因子參與了VILI。在動物實驗中觀察到大潮氣量通氣組(VT=30 mL/kg)家兔BALF中HMGB1水平是小潮氣量通氣組(VT=8 mL/kg)的5倍，而給予抗HMGB1抗體則明顯降低機械通氣引起的肺微血管通透性增加及BALF中的TNF-α含量[13]。臨床研究證實，正常人血清中HMGB1為陰性，長期應用機械通氣的呼吸衰竭患者血清中HMGB1水平顯著升高[14]。我們在體內和體外實驗中均發現，機械牽張可誘導HMGB1在mRNA和蛋白水平的表達增加，且其表達量與牽張強度成正比[3-5]。進一步研究證實，HMGB1還可誘導多種炎癥介質表達釋放，導致炎癥反應的放大和加強，并可能影響機體的凝血及免疫機能[15]。因此，HMGB1在炎癥網絡中可能處于關鍵環節。本研究初步探討了EGFR抑制劑對HMGB1表達的影響，發現EGFR 拮抗劑AG-1478可有效抑制肺組織HMGB1蛋白的表達，從而減輕肺損傷程度。其抗炎作用可能是通過對EGFR酪氨酸激酶活性及其下游有絲分裂信號通路p38的抑制作用實現的。

本實驗證實機械通氣可誘導肺組織EGFR磷酸化激活，進而通過p38 MAPK信號通路誘導HMGB1表達增加，最終引起肺損傷，而應用EGFR拮抗劑可阻斷配體依賴途徑的EGFR激活，在VILI的病理形成過程中，抑制HMGB1蛋白表達，表現出減輕肺損傷的效應，故探討EGFR阻斷劑應用于VILI患者的可能性，將為VILI的防治提供新的思路。

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EGFR-p38MAPKsignalingpathwayisinvolvedinexpressionofHMGB1inpulmonarytissuesofratswithventilator-inducedlunginjury

TANG Chun-lin1, DING Ning2, CHENG Ao-bing2

(1DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedTumorHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510095,China;2DepartmentofAnesthesiology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China.E-mail:dingninggz@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of epidermal growth factor receptor (EGFR)-p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in the expression of high mobility group box 1 protein (HMGB1) in the lung tissues of rats with ventilator-induced lung injury (VILI).METHODSThirty-two healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups (n=8 each): group A, spontaneous breathing; group B, small tidal volume ventilation (VT=8 mL/kg); group C, high tidal volume ventilation (VT=40 mL/kg); group D, high tidal volume ventilation plus EGFR antagonist AG-1478. The rats in group B, group C and group D were mechanically ventilated for 4 h and then all animals were sacrificed.Total protein content and white blood cell (WBC) count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), the lung wet/dry weight ratio (W/D) and myeloperoxidase (MPO) activity were determined. The histological changes of lung tissues were observed by HE staining. The EGFR protein and mRNA expression, p38 MAPK activity and HMGB1 protein expression in the lung tissues were also detected.RESULTSThe inflammatory responses as evidenced by lung HE staining, total protein and WBC in BALF, the lung W/D and MPO activity were significantly higher in group C than those in group A (P<0.05). The mRNA expression of EGFR, EGFR activity, p38 activity and HMGB1 protein level also significantly increased in group C (P<0.05) as compared with group A. Significant decreases in the above indexes in group D were observed as compared with group C.CONCLUSIONHigh tidal volume ventilation induces acute lung injury, which may be related to up-regulation of HMGB1 expression through EGFR-p38 MAPK signal pathway.

Mechanical ventilation; Acute lung injury; Receptors,epidermal growth factor; High mobility group box 1 protein; Mitogen-activated protein kinases

R563.8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.013

1000- 4718(2013)06- 1029- 05

2013- 01- 04

2013- 05- 02

國家自然科學基金資助項目(No. 81272136)；廣東省科技計劃項目(No. 2010B031600011)；廣東省醫學科研基金資助項目(No. A2012278)；廣州市科技計劃重點項目(No. 2012J4100034)；廣州市醫藥衛生科技重點項目(No. 20121A021001)

△通訊作者 Tel: 020-81048310; E-mail: dingninggz@hotmail.com