α7nAChR的激活通過抑制TNF-α表達促進糖尿病小鼠傷口愈合*

范琰琰， 葉光華， 林刻智， 董繆武， 馮相平， 韓軍鴿， 李興彪， 喻林升

(溫州醫學院基礎醫學院法醫學教研室，浙江 溫州 325035)

α7nAChR的激活通過抑制TNF-α表達促進糖尿病小鼠傷口愈合*

范琰琰△， 葉光華， 林刻智， 董繆武， 馮相平， 韓軍鴿， 李興彪， 喻林升

(溫州醫學院基礎醫學院法醫學教研室，浙江 溫州 325035)

目的觀察糖尿病小鼠傷口愈合期間巨噬細胞浸潤及腫瘤壞死因子 α(TNF-α)表達特征，探討α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)特異性激動劑PNU-282987是否可通過抑制TNF-α表達促進糖尿病小鼠傷口的愈合。方法(1) 制作糖尿病小鼠切創模型(糖尿病組)，正常小鼠在相同部位制作相同大小創口作為對照(對照組)，分別于切創后1 d、3 d、5 d、10 d、14 d和21 d(每個時間段5只)提取創口樣本。免疫組化觀察創口中巨噬細胞和成纖維細胞數量，Western blotting檢測TNF-α表達水平，Masson染色觀察膠原沉積情況。 (2) 在糖尿病小鼠切創后，選擇合適的干預時間窗進行PNU-282987干預，然后觀察上述指標變化。結果(1) 與對照組相比，糖尿病組創口愈合明顯延遲，在切創初期的傷口中巨噬細胞數量和TNF-α表達水平較低(P<0.05)，而切創5 d后的傷口巨噬細胞數量和TNF-α表達水平顯著增加(P<0.05)，成纖維細胞數量和膠原含量減少(P<0.05)。 (2) 在切創5 d后對糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987，可顯著減少傷口中TNF-α表達，提高成纖維細胞數量和膠原含量，促進傷口愈合。結論糖尿病傷口愈合具有炎癥反應發生遲但不易消退的特征。在炎癥反應明顯期激活α7nAChR可抑制TNF-α表達，促進糖尿病小鼠的傷口愈合。

糖尿病； 創面愈合； α7煙堿型乙酰膽堿受體； 腫瘤壞死因子α

糖尿病是嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，據統計當前全世界有2.85 億糖尿病患者, 預計到2030年全世界的糖尿病患者將達到4.39億[1]，而傷口愈合能力受損是糖尿病患者的一個嚴重并發癥[2], 如果創口遷延不愈, 則有可能致殘。雖然目前臨床上已有一些手段用來應對糖尿病患者傷口不愈，但治療方法及療效卻十分有限[3]。因此，如何進一步闡明糖尿病患者傷口不愈的機制，逐步更新和完善對其治療的策略已成為當今國內外研究的重點。

傷口愈合是一個多細胞、多分子參與的復雜過程, 可分為炎癥、增殖和再塑3個階段。炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增殖及膠原沉積是傷口愈合中至關重要的事件。經大量研究證實，炎癥反應紊亂是糖尿病傷口愈合的重要特征，遷延不愈的糖尿病傷口中常出現過量的促炎介質。腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor α，TNF-α)是抑制傷口愈合的主要促炎介質之一，其主要由浸潤的巨噬細胞產生，TNF-α大量釋放可誘導成纖維細胞過度凋亡，抑制膠原沉積，最終延遲傷口愈合[4-7]。

我們初期的研究表明，在傷口愈合期間α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)廣泛表達于浸潤的巨噬細胞[8]。據文獻報道，激活α7nAChR可抑制巨噬細胞釋放TNF-α，減輕局部的炎癥反應[9-10]。本研究旨在：(1)建立糖尿病小鼠切創模型，觀察糖尿病小鼠傷口愈合期間巨噬細胞的浸潤特征及TNF-α的表達特征；(2)選擇合適的干預時間窗進行α7nAChR特異性激動劑PNU-282987的干預，觀察α7nAChR的激活對糖尿病傷口中TNF-α表達的影響，探討α7nAChR對糖尿病傷口愈合的調控作用。

材 料 和 方 法

1動物

清潔級ICR小鼠，8周齡，25～30 g，由溫州醫學院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(浙)2005-0061。

2主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma；大鼠抗F4/80單克隆抗體和山羊抗TNF-α多克隆抗體、兔抗熱休克蛋白47(heat-shock protein 47，HSP47)多克隆抗體均購自Santa Cruz；生物素化驢抗兔IgG(H+L)和生物素化羊抗大鼠IgG(H+L)購自Abcam；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體購自Signalchem；ECL發光試劑盒購自Santa Cruz；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3主要方法

3.1糖尿病小鼠切創模型制備 ICR雄性小鼠，體重25～30 g(8周齡)，清潔級，本單位動物中心提供。適應性飼養1周后，禁食12 h，腹腔注射STZ(150 mg/kg)誘導小鼠糖尿病模型，注射3 d后，小鼠禁食12 h，測定小鼠尾靜脈血糖濃度，以空腹血糖濃度≥13.875 mmol/L作為糖尿病造模成功的標準。造模成功的糖尿病小鼠飼養3周后，將小鼠麻醉，剪除背部毛發，然后用活檢穿孔器在其背部正中做一直徑0.6 cm的圓形創口(切除皮膚全層，深達筋膜)，切創后清潔創口，進行敷料敷貼。為了讓敷料不易脫落，敷貼前將安息香酊乙醇溶液均勻涂抹于距創口邊緣1.5 cm處，待其干燥后，3M無菌透明生物敷料(型號1624W)敷貼創口。

3.2動物分組 (1)糖尿病組：按上述方法制作糖尿病小鼠切創模型，分別于切創后1 d、3 d、5 d、10 d、14 d和21 d(每個時間段5只小鼠)去除敷料，進行大體拍照觀察，然后處死小鼠，提取創口樣本；(2)對照組：正常血糖小鼠在相同部位制作相同大小的創口作為對照，分別于切創后相同時點處死小鼠，提取創口樣本； (3)PNU-282987組及陰性對照組：糖尿病小鼠于切創5 d后開始腹腔注射α7nAChR特異性激動劑PNU-282987(生理鹽水稀釋)或等量生理鹽水，分別于切創后10 d、14 d和21 d(每個時段5只小鼠)提取創口樣本。根據文獻報道[11]，PNU-282987的給藥濃度為2.4 mg/kg。

3.3創口愈合形態學觀察 (1)計算機分析數碼相機所拍攝圖像，按以下公式計算創面愈合率。創面愈合率(%)= (創面初始面積-創面形成后第n天的面積)/創面初始面積×100%；(2)提取創口樣本，多聚甲醛固定后制作石蠟切片，采用常規HE染色，觀察創口的組織形態學變化。

3.4免疫組織化學染色 切片脫蠟、水化，滴加3%過氧化氫室溫孵育10 min后，微波法修復抗原。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封閉1 h，滴加大鼠抗F4/80單克隆抗體(稀釋度1∶100)或兔抗HSP47多克隆抗體(稀釋度1∶400)保濕盒內4 ℃孵育過夜；PBS洗滌切片，生物素標記的羊抗大鼠IgG或驢抗兔IgG保濕盒內孵育30 min；滴加SP試劑，保濕盒內孵育60 min；DAB顯色后，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。染色過程中以PBS或非免疫血清替代Ⅰ抗作為陰性對照。顯微鏡(×400) 下每個標本于損傷區隨機選擇10 個視野，計算每個視野中陽性染色細胞數。

3.5Western blotting檢測 冰浴上將各時段皮膚樣本剪碎，加蛋白裂解液300 μL 及苯甲基磺酰氟勻漿，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，用Lowry 法測量蛋白濃度，將樣品置于-80 ℃保存，備用。變性5 min，進行10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉印到PVDF 膜上，轉膜條件為5 V、40 min。含有吐溫的Tris-HCl緩沖液(TBST) 洗滌3 次，用5%脫脂牛奶封閉2 h，用山羊抗TNF-α多克隆抗體(1∶500) 孵育，4 ℃過夜。TBST 洗滌3 次，辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG (1∶10 000) 4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后，電化學發光法(ECL) 發光。使用Scion Image軟件分析各顯色譜帶的灰度，以GAPDH為內參照，計算切創后各時段傷口樣本中TNF-α蛋白的相對表達水平。

3.6Masson染色 切片脫蠟、水化，Weigert蘇木精液染核5～10 min，鹽酸乙醇分化數秒，麗春紅酸性復紅液浸染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，苯胺藍浸染5 min。0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，脫水、透明、封片。顯微鏡(×400) 下每個標本于損傷區隨機選擇10 個視野，應用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統測定膠原容積分數(膠原容積分數=視野中膠原面積/視野創口總面積)。

4統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1創口愈合形態學觀察

1.1創面愈合率 糖尿病組與對照組相比，創面愈合明顯延遲；從切創后第3 d，兩組的創面愈合率即出現明顯差異(5.21%vs32.63%)；至切創后第21 d，糖尿病組小鼠創面均未愈合，而對照組小鼠創面均已完全愈合。與糖尿病組相比，PNU-282987組在切創后10 d、14 d和21 d的創面愈合率顯著增加(分別為40.16%vs78.95%、61.86%vs93.12%和79.89%vs100%)，見圖1。

Figure 1. Percentage of wound healing at different posttraumatic time points (scale bar=2 mm). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

圖1切創后各時點的傷口愈合率

1.2組織形態學觀察 (1)對照組：切創后1～3 d，傷口可見大量炎癥細胞浸潤；傷后3 d成纖維樣細胞開始出現在傷口底部，于傷后5 d 顯著增多，傷后14 d達到峰值；傷后5～10 d，傷口內還可見大量的新生血管，與成纖維樣細胞、炎癥細胞共同形成肉芽組織；傷后14～21 d，損傷區新生血管顯著減少，間質增多，肉芽組織向瘢痕組織轉變；(2)糖尿病組：切創后1～3 d，傷口可見炎癥細胞浸潤，于傷后5 d 顯著增多，傷后10 d達到峰值，至傷后14 d仍可見大量炎癥細胞浸潤；傷后10～21 d，肉芽組織形成，其內可見散在分布的成纖維樣細胞和新生血管；(3)PNU-282987組：糖尿病小鼠切創5 d后開始腹腔注射α7nAChR特異性激動劑PNU-282987，傷后10～14 d，肉芽組織形成，其內可見大量的成纖維樣細胞和新生血管；傷后21 d，損傷區間質增多，肉芽組織向瘢痕組織轉變，見圖2。

Figure 2. Histological examination at different posttraumatic time points (HE staining,×400, scale bar=20 μm).

圖2切創后各時點的組織形態學觀察

2切創后巨噬細胞的浸潤特征及TNF-α的表達特征

2.1巨噬細胞浸潤特征 F4/80(巨噬細胞標記物)的免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，糖尿病組小鼠切創后1～3 d巨噬細胞浸潤顯著減少(P<0.05)，切創后5～14 d創口中巨噬細胞數量顯著增多(P<0.05)，見圖3A。

Figure 3. The number of macrophages and the expression of TNF-α at each posttraumatic time point. A: immunohistochemical staining of F4/80 (macrophage marker) in wound samples at 10 d after injury (×400, scale bar=10 μm) and the number of macrophages at each posttraumatic time point; B: the expression of TNF-α at each posttraumatic time point. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖3切創后各時點巨噬細胞數量及TNF-α的表達情況

2.2TNF-α表達特征 Western blotting檢測顯示，與對照組相比，糖尿病組小鼠切創后1～3 d創口中TNF-α的表達顯著減少(P<0.05)，切創后5～14 d創口中TNF-α的表達顯著增多(P<0.05)，見圖3B；而在切創5 d后對糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987可顯著下調切創后10 d、14 d和21 d創口中TNF-α的蛋白表達水平(P<0.05)，見圖4。

3創口中的成纖維細胞數量和膠原含量

HSP47(成纖維細胞標記物)的免疫組織化學染色及Masson染色顯示，糖尿病組小鼠切創5 d后傷口成纖維細胞數量和膠原含量顯著低于對照組(P<0.05)；而在切創5 d后對糖尿病小鼠腹腔注射PNU-282987可顯著上調切創后10 d、14 d和21 d創口中的成纖維細胞數量和膠原含量(P<0.05)，見圖5、6。

討 論

糖尿病傷口易出現愈合不良現象，而炎癥反應紊亂可能是產生這一現象的重要原因。傷口愈合期間適度的炎癥反應對傷口愈合是必要的，而過度的炎癥可抑制傷口愈合。炎癥反應的維持主要依靠浸潤的巨噬細胞不斷分泌促炎細胞因子，如白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)和TNF-α。在炎癥過程中，巨噬細胞浸潤至傷口可吞噬、清除細菌及壞死組織，同時釋放細胞因子，啟動傷口修復進程[7]。但如果炎癥反應不消退，促炎介質持續釋放，則會抑制傷口愈合。研究顯示，TNF-α是抑制傷口愈合的重要促炎介質，TNF-α的過度釋放可誘導成纖維細胞凋亡，抑制膠原沉積，延遲傷口愈合[5]；而系統的抗TNF-α治療可顯著促進傷口愈合[12]。

Figure 4. The expression of TNF-α in PNU-282987 group (A) and diabetes group (B) at 10, 14 and 21 d after injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsB.

圖4糖尿病組和PNU-282987組的TNF-α表達情況

Figure 5. The number of fibroblasts at different posttraumatic time points. Immunohistochemical staining of HSP47 (fibroblast marker) in wound sample was observed at 14 d after injury (×400, scale bar=20 μm) and the number of fibroblasts at 10, 14 and 21 d after injury was counted. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

圖5切創后各時點成纖維細胞數量

Figure 6. The content of collagen in the wounds at different posttraumatic time points. Masson staining of wound samples was observed at 21 d after injury (×400, scale bar=20 μm) and the collagen volume fraction (CVF) of the wounds at 10, 14 and 21 d after injury was calculated. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdiabetes.

圖6切創后各時點膠原含量

α7nAChR是經典的神經元受體，但也分布于免疫細胞表面[13]。激活α7nAChR可抑制巨噬細胞釋放TNF-α，減輕局部的炎癥反應[8-9]。因此，α7nAChR已開始應用于炎癥性疾病的治療，諸如Crohn病、牛皮癬、類風濕性關節炎、哮喘和敗血癥等[9-10,14]。我們前期研究顯示，在傷口愈合期間α7nAChR廣泛表達于浸潤的巨噬細胞，提示α7nAChR可能在皮膚損傷愈合的炎癥階段發揮重要調控作用[8]。

本研究表明，與對照組相比，糖尿病小鼠的創口愈合明顯延遲。糖尿病組小鼠在切創后1～3 d的創口巨噬細胞浸潤較少，TNF-α表達水平較低；而在切創5 d后，創口中的巨噬細胞數量和TNF-α的表達水平顯著增多；糖尿病傷口的愈合具有炎癥反應發生遲但不易消退的特征。在糖尿病傷口愈合后期，持續浸潤的巨噬細胞可能導致TNF-α釋放增加，抑制傷口愈合。

為了避免干擾創口早期的炎癥反應，我們選擇了在切創5 d后對糖尿病小鼠進行α7nAChR特異性激動劑PNU-282987的干預。與糖尿病組相比，PNU-282987組在切創后10 d、14 d和21 d的創口中TNF-α表達顯著減少，而成纖維細胞數量和膠原含量增多。本研究結果提示，在糖尿病傷口愈合后期激活α7nAChR可能通過抑制巨噬細胞釋放TNF-α，使TNF-α誘導的成纖維細胞凋亡減少，從而促進創口中的膠原沉積，加快傷口愈合，但具體機制仍有待進一步研究證實。此外有報道表明，敲除小鼠的α7nAChR可以促進紫外線誘導的皮膚炎癥，增加損傷灶內促炎介質的釋放[15]。至于糖尿病創口愈合早期的炎癥反應不足現象能否通過抑制α7nAChR進行調節，尚需研究闡明。

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Activationofα7nAChRpromoteswoundhealingindiabeticmicebysuppressingTNF-αexpression

FAN Yan-yan, YE Guang-hua, LIN Ke-zhi, DONG Miao-wu, FENG Xiang-ping, HAN Jun-ge, LI Xing-biao, YU Lin-sheng

(DepartmentofForensicMedicine,SchoolofBasicMedicalScience,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China.E-mail:yyfan998@163.com)

AIM: To explore the role of α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7nAChR)-specific agonist PNU-282987 in promoting wound healing in diabetic mice by suppressing the expression of tumor necrosis factor α (TNF-α).METHODSA model of incised wound was established in diabetic mice or normoglycaemic mice (control). Skin samples were taken on 1 d, 3 d, 5 d, 10 d, 14 d and 21 d post-injury (5 mice in each posttraumatic interval). The numbers of macrophages and fibroblasts, the expression of TNF-α and the deposition of collagen were detected by the methods of immunohistochemistry, Western blotting and Masson staining, respectively. After incised wound was performed in the diabetic mice, PNU-282987 was applied by intraperitoneal injection at suitable posttraumatic interval. The above indexes were investigated again.RESULTSCompared with control group, the diabetic mice presented delayed wound healing. In diabe-tic mice, the infiltration of macrophages and the expression of TNF-α were significantly reduced in the early phase during wound healing, while they were significantly increased from 5 d post-injury. Besides, from 5 d to 21 d post-injury, the wounds in diabetic mice showed decreased number of fibroblasts and deposition of collagen. From 5 d post-injury, PNU-282987 was applied to diabetic mice, which significantly down-regulated the expression of TNF-α, and increased the number of fibroblasts and the content of collagen in the wounds, eventually promoted wound healing.CONCLUSIONInflammatory reactions delay wound healing in diabetic mice. Activation of α7nAChR promotes wound healing in diabetic mice by suppressing the expression of TNF-α.

Diabetes mellitus; Wound healing; α7 nicotinic acetylcholine receptor; Tumor necrosis factor α

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.017

1000- 4718(2013)06- 1053- 06

2012- 12- 25

2013- 04- 28

浙江省自然科學基金資助項目(No.Q13H150005)；溫州醫學院科研發展基金資助項目(No.QTJ12002)

△通訊作者 Tel: 0577-86689816; E-mail: yyfan998@163.com