環境內分泌干擾物雙酚A對小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞增殖和凋亡的影響*

劉澤兵， 王 麗， 葉宣光△， 于秀杰， 張友元

(1復旦大學附屬金山醫院病理科，上海 201508； 2天津醫科大學內分泌研究所衛生部激素與發育重點實驗室，天津 300070)

環境內分泌干擾物雙酚A對小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞增殖和凋亡的影響*

劉澤兵1， 王 麗1， 葉宣光1△， 于秀杰2， 張友元1

(1復旦大學附屬金山醫院病理科，上海 201508；2天津醫科大學內分泌研究所衛生部激素與發育重點實驗室，天津 300070)

目的探討環境內分泌干擾物雙酚A(BPA)對小鼠甲狀腺原代培養細胞增殖和凋亡的影響。方法取雌性BALB/cnu/nu小鼠甲狀腺組織，采用膠原酶I/中性蛋白酶聯合消化并進行濾泡上皮細胞培養，Western blotting檢測甲狀腺球蛋白表達對細胞進行鑒定。采用不同濃度的BPA干預穩定培養48 h的小鼠甲狀腺原代培養的濾泡上皮細胞，作用24 h后，光學顯微鏡觀測干預前后細胞生長狀態的變化，流式細胞術分析細胞增殖和凋亡，real-time PCR法和免疫細胞化學染色法測定干預前后腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體1(TRAIL-R1) mRNA和蛋白的表達變化。結果原代培養的小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞隨BPA刺激濃度的增加，生長狀態呈現先促進后抑制的趨勢；0.01～0.1 μmol/L BPA作用24 h后，細胞增殖呈劑量依賴性增長，0.1 μmol/L BPA可顯著刺激細胞增殖(P<0.05)，而1 μmol/L BPA刺激后則表現為細胞增殖水平顯著下降(P<0.05)；0.1 μmol/L BPA刺激后凋亡指數減低(P<0.05)；0.1 μmol/L和1 μmol/L BPA刺激后TRAIL-R1 mRNA表達均顯著下調(均P<0.05)，蛋白表達與mRNA表達結果趨勢一致。結論低、中濃度BPA可刺激原代培養的小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞增殖并抑制細胞凋亡，而高濃度BPA對細胞主要表現為毒性損害作用。BPA對細胞凋亡的影響可能與TRAIL-R1相關途徑有關。

雙酚A； 細胞增殖； 細胞凋亡； 甲狀腺

環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)包括殺蟲劑、洗滌劑等工業化學物，釋放至人類、動物的生存環境中并產生類激素活性效應。近些年，多項研究發現器官形成期暴露于EEDs可能會導致雄性個體生殖道畸形以及腫瘤形成。而對歐美成年男性人群的一項調查發現，暴露于EEDs可導致精子質量下降并導致男性不育[1]。此外，對于EEDs的致癌性也得到普遍認同，其中因EEDs與激素產生器官和激素作用靶器官特異性腫瘤的發生密切相關而成為研究熱點之一。雙酚A(bisphenol A, BPA)是一類經典的EEDs，具有類雌激素的化學結構并可產生微雌激素效應和雄激素拮抗作用[2]。研究發現，BPA既能刺激前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌等細胞增殖，也能刺激正常人臍靜脈血管內皮細胞增殖[3]。甲狀腺作為機體內最大的內分泌器官參與激素的分泌并受激素調節。因此，我們推測BPA可能對甲狀腺功能調節、腫瘤形成等產生影響。在本研究擬通過觀測BPA對原代培養的小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(thyroid follicular epithelium cells, TFECs)增殖和凋亡的影響，為進一步探討BPA對甲狀腺相關疾病的影響提供實驗數據。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 選用BALB/cnu/nu小鼠(屬SPF/VAF級動物)，約4周齡，雌性，8只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要試劑 BPA和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)均購自Sigma。Trizol、逆轉錄試劑盒、rTaq DNA聚合酶、dNTP mixture和SYBR Green定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa。F-12 Coon’s Modification培養基購自Sigma，膠原酶I和中性蛋白酶(dispase)購自Gibco，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)購自Biochrom。小鼠抗甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)Ⅰ抗購自Lab Vision/Thermo Scientific，β-actin Ⅰ抗購自Sigma，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)受體1(TRAIL-R1)Ⅰ抗購自Santa Cruz，Ⅱ抗及其它免疫細胞化學染色試劑購自上海太陽生物科技公司。

2方法

2.1小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞原代培養方法的建立 將小鼠實施安樂死，無菌分離雙側甲狀腺組織。將每側甲狀腺組織剪切成約15小塊后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，無血清培養基吹洗2遍后，于每只管中加入消化酶(含膠原酶I 206 kU/L和dispase 2.75 kU/L各0.5mL)，37 ℃水浴振蕩消化40 min，振蕩頻率260次/min，然后800 r/min離心10min，棄去上清消化酶并加入1 mL含10%FCS的F-12 Coon’s完全培養基。用滴管反復輕柔吹打(避免產生過多氣泡)，將離心沉淀再次懸勻，直到肉眼幾乎不能見組織塊為止。將細胞懸液接種在24孔細胞培養板上，其中部分孔內預先加入玻璃蓋片以備免疫細胞化學檢測之用。最后置于37 ℃、5%CO2培養箱(Forma Scientific)內培養。次日換液，以后每隔3 d換液1次。每天用倒置顯微鏡(Olympus)觀察細胞形態和生長情況，并拍照記錄觀測結果。F-12 Coon’s完全培養基各添加成分的終濃度分別為：氫化考的松5 μg/L，轉鐵蛋白5 mg/L，胰島素10 mg/L，L-谷氨酰胺0.3 g/L，青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L，FCS 10%[4]。

2.2Western blotting檢測Tg蛋白表達 收集培養72 h且生長狀態良好的甲狀腺濾泡上皮細胞，利用RIPA裂解緩沖液冰上裂解提取蛋白，參照文獻標準方法進行。以β-actin為內參照。

2.3實驗分組 對穩定培養48 h的TFECs進行分組，分為4組，每組6孔：(1)對照組:加入0.01 μmol/L DMSO；(2)低劑量組:加入0.01 μmol/L BPA；(3)中劑量組：加入0.1 μmol/L BPA；(4)高劑量組:加入1 μmol/L BPA。刺激因素作用時間均為24 h。

2.4形態學觀測 在倒置相差顯微鏡下觀測刺激前后原代培養的TFECs濾泡單位、單個細胞形態及折光性等方面的改變，并進行拍照紀錄。

2.5流式細胞術檢測細胞增殖與凋亡 刺激因素作用24 h后，胰酶消化并反復吹打至單細胞、過篩，調整細胞濃度約1×106/L，借助流式細胞儀檢測細胞周期，計算細胞增殖指數(proliferation index, PI)參考公式：PI(%)= (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。同時計算凋亡指數(apoptotic index, AI)，依據公式：AI(%)=凋亡細胞數/所測細胞總數×100%。

2.6免疫細胞化學染色法測定TRAIL-R1蛋白表達 將長有細胞的玻璃蓋片從細胞培養板內取出，4%中性多聚甲醛固定6 h，PBS浸泡2 h后按照試劑操作說明書對TFECs進行TRAIL-R1蛋白標記，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片作為陽性對照，DAB顯示8 min，最后蘇木素復染。結果判定：經DAB顯色后細胞質內出現棕黃色細小或斑塊狀物為陽性細胞。

2.7Real-time PCR法檢測TRAIL-R1 mRNA表達 采用上述方法收集單細胞，加入適量Trizol提取細胞總RNA，然后RT-PCR法合成cDNA，以cDNA為模板借助SYBR Green real-time PCR法檢測TRAIL-R1 mRNA表達差異。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內參照。各引物序列如下：TRAIL-R1 正義鏈5’-ACGTCTCCAGTCTGAGTC-3’，反義鏈5’-ACGTCTCCAGTCTGAGTC-3’；GAPDH 正義鏈5’-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3’，反義鏈5’-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3’。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 13.0統計軟件包進行分析，多組間比較采用方差分析或秩和檢驗(K-W檢驗)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1TFECs形態學改變

成功培養的小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞呈貼壁式生長、細胞呈上皮樣、多角形，培養體系穩定后細胞的折光性強表示細胞活力好，反之則表示細胞活力下降。與對照組比較，0.01～0.1 μmol/L BPA刺激后TFECs折光性增強，且隨濃度的增加細胞密度顯著增加，1 μmol/L BPA干預后濾泡團折光性下降呈暗黑色，細胞角突縮短，且胞質內深色顆粒增多，細胞密度下降，主要表現為類毒性損害作用，見圖1。

2TFECs表達Tg蛋白

Western blotting檢測到原代培養的TFECs穩定表達甲狀腺濾泡上皮特異性標志Tg，見圖2。

3BPA對TFECs增殖與凋亡的影響

與對照組比較，0.1 μmol/L BPA組PI顯著增高，約為對照組的5倍(P<0.05)；1 μmol/L BPA組PI則明顯下降，約為DMSO組的0.7倍(P<0.05)。與對照組比較,0.1 μmol/L BPA組AI顯著減低，約為對照組的0.6倍(P<0.05),見圖3、4。

Figure 1. The morphological changes of primarily cultured TFECs with the stimulation of different concentrations of BPA under light microscope (×100).A:DMSO; B: 0.01 μmol/L BPA; C: 0.1 μmol/L BPA; D: 1 μmol/L BPA.

圖1倒置相差顯微鏡下觀測不同濃度BPA刺激原代培養的TFECs形態學變化

Figure 2. The expression of thyroglobulin (Tg) in cultured TFECs (Western blotting).

圖2甲狀腺濾泡上皮細胞Tg蛋白表達

Figure 3. Effect of different concentrations of BPA on proliferation index of TFECs.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDMSO group.

圖3不同濃度BPA對增殖指數的影響

Figure 4. Effect of different concentrations of BPA on apoptotic index of TFECs.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDMSO group.

圖4不同濃度BPA對凋亡指數的影響

4凋亡相關基因TRAIL-R1mRNA表達變化

Real-time PCR檢測目的基因所得數據采用2-ΔΔCt法比較相關基因在各濃度組TFECs中的表達差異。與對照組比，0.1 μmol/L BPA組和1 μmol/L BPA組TRAIL-R1 mRNA表達均顯著下調(均P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The changes of TRAIL-R1 mRNA expression in the TFECs stimulated by different concentrations of BPA.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDMSO group.

圖5不同濃度BPA刺激下TRAIL-R1mRNA表達變化

5TRAIL-R1蛋白表達變化

免疫細胞化學法分析不同濃度BPA作用下TFECs表達TRAIL-R1蛋白情況，結果顯示陽性TFECs胞質存在棕褐色顆粒或片狀物。與對照組比較，其余3組著色強度均呈一定程度下降，但0.1 μmol/L BPA組和1 μmol/L BPA組下降較為明顯，其中0.1 μmol/L BPA組著色強度下降最為顯著，見圖6。

Figure 6. The immunocytochemical analysis of TRAIL-R1 expression in primarily cultured TFECs stimulated by different concentrations of BPA (×100). A: DMSO; B: 0.1 μmol/L BPA; C: 1 μmol/L BPA.

圖6免疫細胞化學法分析不同濃度BPA作用下TRAIL-R1蛋白的表達

討 論

BPA 是人工合成的苯酚和丙酮的衍生物之一，并作為原料被廣泛應用于化工、醫藥等領域。隨著全球環境污染的日益嚴重, 人群暴露于BPA的危害得到普遍關注。目前，BPA的研究主要集中在人體暴露途徑、暴露程度、機體內藥物代謝動力學、毒性機制以及與腫瘤的相關性等方面[2]。多項研究證實，BPA具有類雌激素的化學結構并可產生微雌激素效應和雄激素拮抗作用。Dairkee等[5]利用BPA刺激原代培養的高危人群乳腺上皮細胞，結果BPA能夠持續激活mTOR途徑，同時伴劑量依賴性細胞凋亡逃逸和增殖促進。進一步研究發現，BPA可顯著下調細胞周期前凋亡負性調節因子(p53、p21WAF1及Bax)的表達，同時上調增殖啟動基因(增殖性核抗原、細胞周期蛋白及pRb)表達[6]。

本實驗首先采用雙酶聯合消化法收獲單個甲狀腺濾泡，而這些濾泡區別傳統意義上的組織塊培養和單細胞原代培養，我們將單個濾泡體外接種后短期內可維持極性狀態，與細胞系比較則更接近細胞的在體狀態，同時我們采用Western blotting法檢測到原代培養的TFECs 穩定表達Tg蛋白，從而完成細胞鑒定。此原代培養方法的建立，有利于對甲狀腺濾泡上皮細胞功能調節以及腫瘤形成等方面的研究。低～中等濃度BPA刺激 TFECs后，細胞顯示活力增強、生長旺盛；而濃度繼續升高至1 μmol/L時細胞活力顯著下降，表現為細胞角突縮短、生長緩慢、細胞內出現黑色類似中毒顆粒樣物及折光性減弱。張帥帥等[7]實驗證明高濃度BPA可導致人乳腺癌細胞系MCF-7細胞核DNA嚴重受損、細胞增殖顯著受抑以及細胞膜通透性改變伴大量乳酸脫氫酶等細胞毒性損害作用，與本實驗所觀測到的結果一致。

本研究利用流式細胞術檢測不同濃度BPA對TFECs增殖指數和凋亡指數的影響，結果發現低、中濃度BPA主要表現其弱雌激素樣作用，可導致劑量依賴性PI增加和AI減低，而高濃度BPA則表現為PI和AI顯著減低。結合參考文獻，進一步分析推測高濃度BPA對TFECs可能主要表現為毒性損害作用、導致細胞活力下降，增殖必然受抑，而凋亡指數由于可能受到細胞死亡等混雜因素影響不一定會顯著改變。鄭繼翠等[3]報道BPA能夠促進人臍靜脈血管內皮細胞的體外增殖與Ptak等[8]實驗證實BPA能夠促進卵巢癌細胞系OVCAR-3細胞增殖同時抑制凋亡相關因子caspase-3活性等結果與本研究結果一致。此外， TRAIL-R1在誘導細胞凋亡過程中發揮重要作用，是凋亡信號轉導通路中的關鍵分子。TRAIL-R1與炎癥形成及腫瘤發生、發展密切相關[9-10]，靶向TRAIL-R1抗腫瘤策略也不斷被報道[11]。我們還對BPA影響TFECs凋亡的機制進行了初步探討，在mRNA和蛋白水平檢測凋亡相關基因TRAIL-R1的表達，并發現中、高濃度BPA能夠顯著抑制TRAIL-R1 mRNA表達，中等濃度BPA可抑制TRAIL-R1蛋白表達，表現為陽性細胞數量的減少以及陽性細胞著色強度的減低。

總之，低、中濃度BPA對原代培養的TFECs增殖具有促進作用，對其凋亡產生抑制作用，而高濃度BPA則主要表現細胞毒性損害作用；低、中濃度BPA對細胞凋亡的影響可能是通過TRAIL-R1途徑實現的。

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EffectsofenvironmentalendocrinedisruptorbisphenolAonproliferationandapoptosisofmousethyroidfollicularepitheliumcells

LIU Ze-bing1, WANG Li1, YE Xuan-guang1, YU Xiu-jie2, ZHANG You-yuan1

(1DepartmentofPathology,JinshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai201508,China;2KeylaboratoryforHormoneandDevelopmentofMinisterofHealth,InstituteofEndocrinology,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China.E-mail:yypertussis@163.com)

AIM: To investigate the effect of environmental endocrine disruptor bisphenol A (BPA) on the proliferation and apoptosis of primarily cultured mouse thyroid follicular epithelium cells (TFECs).METHODSThe thyroids of female BALB/cnu/numice were digested by the combination of collagenase I and dispase. The isolated TFECs were cultured and identified by Western blotting. After cultured for 48 h, the TFECs were stimulated with different concentrations of BPA for 24 h. The morphological changes of TFECs were observed under light microscope. The cells were digested and harveste,and the proliferation and apoptosis were determined by the application of flow cytometry. The expression of TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1 (TRAIL-R1) at protein and mRNA levels was investigated by the methods of immunocytochemistry and real-time PCR, respectively.RESULTSWith the increase in BPA concentration, the growth of TFECs was firstly promoted and then inhibited. Dose-dependent proliferation was exhibited by the stimulation of BPA at 0.01～0.1 μmol/L, and proliferation index (PI) was significantly enhanced by 0.1 μmol/L BPA and attenuated by 1 μmol/L BPA. The apoptotic index (AI) was significantly decreased by 0.1 μmol/L BPA. The expression of TRAIL-R1 at mRNA and protein levels was drastically down-regulated by 0.1 μmol/L and 1 μmol/L BPA.CONCLUSIONProliferation of TFECs is promoted by the stimulation of low to medium concentrations of BPA,while high concentration of BPA mainly exhibits a toxic effect. Additionally, the effect of BPA on apoptosis is potentially mediated through TRAIL-R1-related pathway.

Bisphenol A; Cell proliferation; Apoptosis; Thyroid gland

R736.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.021

1000- 4718(2013)06- 1076- 05

2013- 04- 02

2013- 04- 13

上海市金山科學技術創新項目(No. 2011-3-12); 上海市衛生局面上科研基金資助項目(No. 20100051)

△通訊作者 Tel： 021-34189990-5376； E-mail： yypertussis@163.com