DKK1基因沉默的人多發性骨髓瘤細胞培養上清對小鼠前成骨細胞成骨分化的影響*

章 瑜， 俞 康

(溫州醫學院附屬第一醫院血液科，浙江 溫州 325000)

DKK1基因沉默的人多發性骨髓瘤細胞培養上清對小鼠前成骨細胞成骨分化的影響*

章 瑜， 俞 康△

(溫州醫學院附屬第一醫院血液科，浙江 溫州 325000)

目的初步探討一種與胚胎發生及腫瘤發展密切相關的糖蛋白Dickkopf-1(DKK1)在骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)發病中的作用。方法前期實驗構建的質粒pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR，與慢病毒包裝質粒一起包裝成慢病毒，感染人骨髓瘤U266細胞，建立DKK1沉默的U266細胞。小鼠前成骨細胞MC3T3-E1體外成骨誘導實驗分組：空白對照組、誘導分化組、30% U266上清干預組、30%DKK1 RNAi U266上清干預組和30%無關序列RNAi U266上清干預組；誘導培養12 d后，通過茜素紅染色檢測鈣結節數目；real-time PCR檢測骨鈣素(osteocalcin，OC)mRNA的表達變化。結果成骨誘導體系中，與空白組比較，誘導組OC mRNA有明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與誘導組比較，30% U266上清干預組OC mRNA表達明顯減少(P<0.01)。與30% U266上清干預組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預組OC mRNA表達明顯增多(P<0.05)，30%無關序列RNAi U266上清干預組OC mRNA差異無統計學意義。與誘導組比較，30% U266上清干預組鈣結節計數明顯減少(P<0.01)。與30% U266上清干預組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預組鈣結節計數明顯增多(P<0.05),30%無關序列RNAi U266上清干預組鈣結節計數差異無統計學意義(P>0.05)。結論U266細胞中DKK1基因沉默后，其培養上清抑制小鼠前成骨細胞MC3T3-E1成骨分化的能力減弱。

Dickkopf-1蛋白; 骨髓瘤骨病; 骨鈣素

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細胞疾病。而80%左右的患者伴有嚴重骨痛及病理性骨折的表現，即骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)[1]。發生MBD的MM患者因骨痛﹑病理性骨折和高鈣血癥等，生活質量受到嚴重影響[2]。更重要的是，與沒有病理性骨折的患者比較，病理性骨折的MM患者死亡風險增加20%以上[3-4]。因此，加強對MBD的研究和尋找有效的治療方法迫在眉睫。

既往研究中多專注于對破骨細胞的研究[5-6]，但同時有研究發現，通過對破骨細胞抑制來減少骨的重吸收，并不能改善骨質損害的修復[7]。成骨細胞功能的受損在MM病人骨損害的發展中起亦著重要作用。 許多研究表明經典的 Wnt 信號轉導途徑對正常的骨發育和腫瘤相關骨病的發生是非常重要的[8]，Wnt途徑及它的抑制物Dickkopf-1 (DKK1)參與了骨轉移過程。Gunn等[9]發現, 具有溶骨性病變的MM患者的骨髓瘤細胞能分泌高水平的DKK1, 通過抑制Wnt途徑，阻止間充質干細胞向成骨細胞分化。許多研究機構把DKK1的中和抗體應用于小鼠和人體的骨質疏松研究中，都取得了預期的良好效果[10-11]。但是中和抗體不能從根本上解決問題，本實驗就嘗試基因沉默的效果。

材 料 和 方 法

1材料

人多發性骨髓瘤細胞株U266購于中國科學院腫瘤研究所(ATCC編號：TIB-196)，小鼠前成骨細胞MC3T3-E1為溫州醫學院附屬第一人民醫院醫科所保存。

2主要試劑

高糖DMEM液、RPMI-1640液、低糖DMEM液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購于Gibco；Trizol購于Invitrogen; 茜素紅粉劑購于國藥集團；重組人骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)購于R&D；PCR 引物由上海賽百盛生物工程公司生產。

3主要方法

3.1DKK1沉默的人多發性骨髓瘤細胞系U266的建立 本實驗室前期研究已完成[12]。

3.2體外前成骨細胞誘導體系實驗分組 (1)空白對照組：予總體積3 mL 10%FBS-DMEM完全培養液；(2)誘導分化組：予總體積3 mL含50 μg/L BMP-2的完全培養液；(3) 30% U266上清干預組：予總體積3 mL 含30% U266細胞上清和50 μg/L BMP-2的完全培養液； (4)30%DKK1 RNAi U266上清干預組：予總體積3 mL含DKK1 RNAi的U266細胞培養上清液和50 μg/L BMP-2的完全培養液； (5)30%無關序列RNAi U266上清干預組：予總體積3 mL含無關序列RNAi的U266細胞培養上清液和50 μg/L BMP-2的完全培養液。取MC3T3-E1細胞2.0×104個于6孔培養板上，每組加入上述培養液，37 ℃、5% CO2培養箱培養。每3 d換液1次，每孔加入相同的培養液，12 d后收獲細胞。

3.3茜素紅染色及鈣結節計數 按實驗分組培養MC3T3-E1細胞，12 d后收獲細胞。去除各孔培養液，以PBS清洗，以95%乙醇室溫固定10 min，流水沖洗，晾干。將配置好的0.2%茜素紅染液加入到固定好的細胞上， 置37 ℃水浴箱中染色10 min。去除染液，流水沖洗，100倍倒置顯微鏡下雙盲法染色結節計數。

3.4Real-time PCR測定 按照總RNA抽提試劑盒說明書的使用步驟對各實驗組細胞進行總RNA的抽提;按照逆轉錄酶使用說明將樣本mRNA逆轉錄為cDNA。小鼠骨鈣素(osteocalcin,OC)上游引物5’-AGGAGGGCAATAAGGTAGTGAA-3’，下游引物5’-TACCGTAGATGCGTCTGTAGGC-3’，目的長度165 bp；小鼠GAPDH上游引物5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’，目的長度148 bp。Real-time PCR反應體系為25 μL，含cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，2× PCR Mix 12.5 μL，無核酸酶水9.5 μL。在ABI 7500 PCR儀上進行real-time PCR檢測， 每個樣本做3個復孔， 擴增條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。進行3次組內重復后, 以公式2-ΔΔCt[ΔCt(待測樣本)=待測基因Ct-內參照基因Ct，ΔΔCt=ΔCt(待測樣本)-ΔCt(對照樣本)]計算待測基因的相對表達量[13]。

4統計學處理

SPSS 17.0 軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組樣本均數比較采用單因數方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD法(方差齊性)或 Dunnet-T3 法(方差不齊)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1各實驗組中鈣結節計數

空白對照組細胞基本無結節染色，誘導組可見細胞外沉積的鈣被染成紅色鈣結節，呈陽性反應；30% U266上清干預組和30%無關序列RNAi U266上清干預組與BMP-2誘導組比較，鈣結節計數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。30%DKK1 RNAi U266上清干預組與30% U266上清干預組比較，鈣結節計數增多，差異有統計學意義(P<0.05)，而30%無關序列RNAi U266上清干預組與30% U266上清干預組比較，鈣結節計數差異無統計學意義(P>0.05),見圖1、表1。

Figure 1. Calcium nodules in different groups in aninvitropreosteoblast induction system (alizarin red staining,×100).A：blank control group;B：BMP-2 induction group;C：U266 supernatant group;D：DKK1 RNAi U266 supernatant group;E：negative RNAi U266 supernatant group.

圖1體外前成骨細胞誘導體系實驗各組鈣結節染色結果

表1各組鈣結節計數結果

Table 1. Calcium nodule count results in different groups (Mean±SD.n=3)

GroupCalciumnodulecountBlankcontrol0.750±0.250BMP-2induction13.250±1.493▲▲U266supernatant4.500±1.041DKK1RNAiU266supernatant9.000±1.472*NegativeRNAiU266supernatant5.000±0.408

▲▲P<0.01vsblank control group;*P<0.05vsU266 supernatant group.

2各實驗組中OCmRNA的表達

SYBR real-time PCR結果顯示：與空白組比較，BMP-2誘導組OC mRNA有明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與誘導組比較，30% U266上清干預組OC mRNA表達減少，差異有統計學意義(P<0.01)；與30% U266上清干預組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預組OC mRNA表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)，而30%無關序列RNAi U266上清干預組OC mRNA表達差異無統計學意義，見表2。

表2各組OCmRNA的相對表達量

Table 2. The expression of OC mRNA in different groups detected by real-time PCR (Mean±SD.n=3)

GroupΔCt 2-ΔΔCtBlankcontrol7.485±1.0211BMP-2induction4.368±0.988▲▲8.586U266supernatant6.662±0.473##1.760DKK1RNAiU266superna-tant5.103±0.249*5.195NegativeRNAiU266superna-tant7.271±1.140##1.156

▲▲P<0.01vsblank control group;##P<0.01vsBMP-2 induction group;*P<0.05vsU266 supernatant group.

討 論

骨髓瘤相關的骨病一直是MM治療的一個難題。其治療方法不外乎雙膦酸鹽藥物、放化療和手術治療，這些治療方法的目的在于預防骨相關事件的發生，延緩溶骨性病損的進展和骨痛，只能控制癥狀。MBD的形成是破骨細胞活性增強與成骨細胞抑制的結果。而且越來越多的研究表明單方面抑制破骨細胞的活性并不能有效改善骨質破壞，成骨細胞的作用不容忽視。DKK1可以抑制成骨細胞，從而促成MBD的發生，而且有研究發現封閉DKK1可以直接影響腫瘤內環境從而延緩腫瘤的生長[10]，所以DKK1不論在MBD方面還是在腫瘤本身都是一個關鍵的因素。在本實驗在體外成骨誘導體系中評估DKK1沉默后骨髓瘤細胞培養上清對前成骨細胞分化的影響，結果發現代表成骨的相關基因表達水平明顯高于沉默前的水平，說明成骨抑制情況明顯改善。無關序列RNAi與沉默前的成骨基因表達水平的差異沒有統計學意義，進一步說明了DKK1 siRNA能較特異地與目的基因結合，具有特異性。

本實驗為接下來更深入地探討多發性骨髓瘤細胞的成骨抑制分子機理奠定基礎，為臨床上靶向治療多發性骨髓瘤骨病提供了體外研究的理論依據。

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EffectofculturesupernatantofhumanmultiplemyelomacellswithDKK1genesilencingonosteogenicdifferentiationofmousepreosteoblasts

ZHANG Yu, YU Kang

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yukang62@126.com)

AIM: To investigate the effect of Dickkopt-1 (DKK1) gene on myeloma bone disease.METHODSLentivirus was packed with pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR plasmids and lentivirus packaging plasmids, and then transfected into human multiple myeloma cell line U266. Aninvitroosteogenic experiment was performed and the mouse MC3T3-E1 preosteoblasts were divided into blank control group, bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) induction group, U266 supernatant group,DKK1 RNAi U266 supernatant group and negative RNAi U266 supernatant group. All supernatants added to the cells were at the concentration of 30%. After culture for 12 d, the effects of different U266 cell supernatants on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells were investigated by alizarin red staining. The mRNA expression of osteocalcin (OC) was detected by real-time PCR.RESULTSCompared with blank control group, the mRNA expression of OC in BMP-2 induction group increased significantly. Compared with BMP-2 induction group, the mRNA expression of OC and the number of calcium nodule in U266 supernatant group were decreased. Compared with U266 supernatant group, the mRNA expression of OC and the number of calcium nodule inDKK1 RNAi supernatant group were significantly eleva-ted. In negative RNAi U266 supernatant group, OC mRNA and the calcium nodule did not change significantly.CONCLUSIONAfterDKK1 gene silencing in U266 cells by RNAi, the inhibition of osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts significantly decreases.

Dickkopf-1 protein; Myeloma bone disease; Osteocalcin

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.029

1000- 4718(2013)06- 1129- 04

2013- 01- 17

2013- 05- 08

溫州醫學院 5010 重大項目子課題(No.XNK05005)

△通訊作者 Tel： 0577-55579489; E-mail: yukang62@126.com