原核表達和制備EB 病毒GST/BFRF3融合蛋白用于鼻咽癌的診斷篩查*

胡 波， 陳忠城， 王東寧， 李 林△

(中山大學附屬第三醫院 1檢驗科， 2血液內科，廣東 廣州 510630)

·實驗技術·

原核表達和制備EB 病毒GST/BFRF3融合蛋白用于鼻咽癌的診斷篩查*

胡 波1， 陳忠城1， 王東寧2， 李 林1△

(中山大學附屬第三醫院1檢驗科，2血液內科，廣東 廣州 510630)

目的構建表達EB病毒衣殼抗原BFRF3基因的原核細胞表達載體并探討其在鼻咽癌血清學診斷中的應用。方法以EB病毒 DNA為模版，采用PCR法擴增目的基因BFRF3，與原核表達載體PGEX-5X-1連接，構建PGEX-5X- BFRF3重組質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達GST/BFRF3融合蛋白。表達產物經SDS-PAGE和免疫印跡法鑒定后，純化目的蛋白作為包被抗原，制備ELISA試劑檢測鼻咽癌患者和正常人群BFRF3-IgA抗體。結果在大腸桿菌中成功地表達了GST/BFRF3融合蛋白，相對分子質量為44 kD，免疫印跡證實目的蛋白帶有免疫原性，目的蛋白經純化后作為包被抗原檢測鼻咽癌患者的靈敏度和特異度分別為65%和87%。結論采用原核表達系統成功構建并表達了GST/BFRF3融合蛋白，其在鼻咽癌血清篩選中具有診斷價值。

鼻咽腫瘤； EB病毒衣殼抗原； 原核表達

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為雙鏈DNA病毒，與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 關系密切。廣東省為NPC高發區，發病率居世界首位，NPC的早期診斷和治療是提高患者生存率、改善生存質量的重要手段之一。NPC的早期癥狀不明顯，原發部位隱蔽不易發現，明顯癥狀直到疾病晚期才被認識，確診往往因此而受到延誤，從而令病人錯過最佳治療時機。研究證明絕大多數NPC患者癌細胞中均存在著EBV基因組成分，NPC患者血清中具有針對多種EB病毒抗原的抗體譜，其中包括病毒衣殼抗原(viral capsid antigen,VCA)、早期抗原(early antigen,EA)和EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen1,EBNA1)等,且針對這些抗原的特異性抗體效價的升高常發生在臨床發現腫瘤之前。因此在NPC高發區人群進行該類抗體普查對于NPC的早期診斷、抗腫瘤治療進程的監控以及流行病學調查有著重要的意義[1-3]。

EBV VCA是重要診斷抗原，其IgA抗體出現在大多數NPC病人和NPC易患者的血清內，檢測血清中VCA-IgA抗體在NPC的早期診斷上意義重大。但VCA蛋白復合物成份復雜，至少由30種不同的蛋白組成，在體外很難對VCA家族的蛋白水平和抗原數量進行完全定義，針對NPC病人VCA-IgA抗體的相關靶抗原分子仍無法充分定位[4]。為及時而準確地對NPC患者進行早期診斷和治療，利用DNA重組技術尋找理想的基因工程EBV VCA抗原用于制備診斷試劑，已成為亟待解決的問題。p18是VCA的主要抗原多肽之一，由EB病毒基因組中BFRF3基因編碼。本實驗室曾在酵母中分泌表達了BFRF3重組蛋白[5]，當用發酵罐進行大批量發酵時，表達的BFRF3重組蛋白活性與產率卻均過低。本研究采用原核表達系統，將VCA中的BFRF3基因與原核表達載體PGEX-5X-1連接，構建PGEX-5X-BFRF3原核表達質粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達GST/BFRF3重組融合蛋白，并將其作為包被抗原，制備ELISA試劑對NPC 病人和健康對照人群進行檢測，分析其靈敏度和特異度，探討BFRF3重組融合蛋白在NPC免疫檢測中的應用及意義，期望能夠得到有價值的大量表達BFRF3重組蛋白的PGEX-5X-BFRF3原核表達菌株。

材 料 和 方 法

1材料

1.1標本來源 300份病理確診為NPC患者的血清樣本來自中山大學附屬腫瘤醫院和江蘇省腫瘤醫院。男性221例，女性79例，平均年齡(45±25)歲，均為首次發現，未經治療。500份健康對照組標本來自中山大學附屬第三醫院健康體檢者，男性372例，女性128例，平均年齡(43±22)歲(采集時間2003～2005年)。372份EB病毒 PCR陽性或陰性的血清[陽性75份，陰性297份，平均年齡(42±20)歲，采集時間2005年]來自南方醫科大學附屬南方醫院及附屬珠江醫院，EB病毒 PCR定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因有限公司, PCR儀為Roche LightCycler及BioRad MJ Option II型；單純皰疹病毒抗體檢測試劑盒檢出的IgM、IgG陽性標本21份、巨細胞病毒IgM、IgG檢測試劑盒檢出的陽性標本27份均來自中山大學附屬第三醫院門診患者，試劑購自ZENS SCIENTIFIC INC。

1.2病毒DNA模板、質粒與關鍵試劑 EB病毒轉化的淋巴瘤細胞株B95-8細胞購自中山大學基礎醫學院，大腸桿菌JM109用于所有質粒擴增，原核表達載體pGEX-5X-1、E.coliBL21(DE3)和GST·BindTMKits 購自Novagen。病毒DNA抽提試劑盒購自上海生物工程公司。DNA回收及純化試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自Qiagen。所有內切酶及T4 DNA連接酶均購自New England Biolabs。EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒購自北京貝爾生物工程有限公司。

2方法

2.1重組質粒的構建及鑒定 EBV DNA的提取參照文獻[5]，以EBV DNA為模板擴增BFRF3基因(531 bp)，擴增引物由上海博亞公司合成，引物序列如下：上游引物5’-GGAATTCATGGCACGCCGGCTGCC-3’，下游引物5’-CGGCGGCCGCTTACTGTTTCTTACGTGCCCCGCGT-3’。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，定向克隆到原核表達載體pGEX-5X-1中，轉化E.coliBL21(DE3) 感受態細胞，在含氨芐青霉素的LB 平板上篩選陽性克隆，提取質粒DNA，雙酶切電泳及DNA 序列分析鑒定重組質粒pGEX-5X-BFRF3。

2.2BFRF3重組蛋白的誘導表達 挑選構建成功的重組質粒pGEX-5X-BFRF3和空質粒pGEX-5X-1轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，37 ℃培養過夜后，分別挑取重組載體和空載體的單克隆菌落接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃培養過夜。各取上述過夜菌100 μL轉接入10 mL含氨芐青霉素的新鮮LB中，37 ℃振蕩培養至A600為0.5時，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，35 ℃誘導培養4 h，離心去上清,收集培養物。菌體重懸于8倍于菌體總量的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲破菌，加入Triton X-100至1%，抑肽酶至1 mg/L，DNase I(終濃度為10 mg/L)，室溫放置30 min，作用至菌液不再黏稠，SDS-PAGE和薄層蛋白掃描定量分析目的蛋白表達。

2.3篩選IPTG 誘導目的蛋白表達的最佳濃度和時間 將陽性轉化菌培養物分裝于5支試管中，加入不同濃度(1.0 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L和0.2 mmol/L) 的IPTG 誘導目的蛋白表達，在誘導表達4 h 時，分別收集樣本，超聲破菌后收集細胞裂解液，采用ELISA 法對目的蛋白進行分析。選取IPTG 的最佳誘導濃度，分別于誘導后1 h、2 h、3 h、4 h和5 h收集樣本，超聲破菌后，再用ELISA 法測定目的蛋白的效價,以確定最佳誘導時間。

2.4重組BFRF3蛋白的鑒定 取步驟2.2項所得樣品，經SDS-PAGE電泳后轉染PVDF膜，加入兔抗GST多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，然后加入HRP標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)，進行Western blotting檢測。

2.5重組BFRF3蛋白的純化 收集IPTG誘導表達后的pGEX-5X-BFRF3陽性轉化菌的培養物，超聲破菌后，棄上清。沉淀用8 mol/L尿素變性，待沉淀充分溶解后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，梯度稀釋復性，使用GST·BindTMKits，過GST柱層析純化融合蛋白，收集樣品用SDS-PAGE和ELISA檢測蛋白活性和純度。

2.6VCA-IgA抗體的檢測 稀釋純化的BFRF3重組蛋白，每孔100 ng∶100 μL包被聚丙乙烯反應板，PBS封閉。HRP標記的羊抗人IgA Fab段作為探針，用間接ELISA法檢測NPC患者和健康體檢標本的血清BFRF3-IgA水平，四甲基聯苯胺為底物，450 nm波長處測定吸光度(A)。固相抗原及酶標記物的最佳工作濃度用方陣滴定確定。通過ROC曲線確定臨界值(cut-off值)。靈敏度為NPC患者標本中的陽性檢出率，特異度為健康對照組中的陰性檢出率。相同標本同時用北京貝爾生物工程有限公司 EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒進行檢測。

2.7特異度評價 EB病毒PCR檢測陽性或陰性血清、單純皰疹病毒I型、II型IgM、IgG抗體陽性血清、巨細胞病毒IgM、IgG抗體陽性血清分別用上述BFRF3重組蛋白制備的EBV VCA-IgA抗體檢測試劑進行檢測。

3統計學處理

統計分析用SPSS 12.0軟件。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。各組間計數資料的比較采用2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1PCR擴增BFRF3基因

以質粒EBV DNA為模板擴增BFRF3基因，PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定，在531 bp處可見到清晰條帶，與理論上BFRF3基因的大小完全符合，見圖1。

Figure 1. PCR amplication ofBFRF3 gene. 1: PCR product ofBFRF3 gene (531 bp)； M： DGL2000 DNA marker.

圖1PCR擴增BFRF3基因

2pGEX-5X-BFRF3載體構建和蛋白表達

BFRF3經PCR擴增后，插入載體pGEX-5X-1的相應位點，得到重組質粒pGEX-5X- BFRF3，經序列分析及雙酶切鑒定表明，BFRF3基因序列正確，基因插入方向無誤,見圖2。

Figure 2. Double digestion of recombinant plasmid PGEX-5X-BFRF3 byEcoR I andNotI. M：DGL2000 DNA marker；1：double digestion of PGEX-5X-1 plasmid byEcoR I+NotI； 2：double digestion of recombinant plasmid PGEX-5X-BFRF3 byEcoR I+NotI.

圖2重組質粒PGEX-5X-BFRF3的雙酶切分析

含空質粒pGEX-5X-1與含重組質粒PGEX-5X-BFRF3的工程菌株BL21(DE3)，在對數生長期，即A600約為0.5時，0.6 mmol/L IPTG誘導4 h后，進行SDA-PAGE分析結果表明，含PGEX-5X-BFRF3重組質粒的菌株誘導后在分子量約44 kD處有明顯的蛋白表達帶，與預測的GST/BFRF3融合蛋白的相對分子質量相符，表達水平約占總蛋白的30%， 見圖3。而含空質粒菌株誘導后在分子量約26 kD處有明顯的蛋白表達帶，與理論上的GST相對分子質量相符。誘導重組蛋白表達的誘導劑 IPTG 最佳濃度為0.6 mmol/L，最佳誘導時間為4 h，ELISA檢測效價為1∶25 600。

Figure 3. SDS-PAGE analysis of recombinant protein. M: low molecular weight protein marker; 1: the total protein of induced PGEX-5X-1/BL21(DE3)；2: the total protein of induced PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3).

圖3重組蛋白的SDS-PAGE分析

3重組GST/BFRF3融合蛋白的鑒定

將誘導表達的菌株總蛋白經SDS-PAGE電泳后，電轉移到PVDF膜上進行Western blotting分析，以抗GST的多克隆抗體為Ⅰ抗，結果顯示重組質粒PGEX-5X-BFRF3轉化菌在44 kD處出現一特異性的反應條帶，與預測的GST/BFRF3融合重組蛋白的相對分子質量相符，空質粒轉化菌則在26 kD處出現一特異性的反應條帶，見圖4。

4重組GST/BFRF3融合蛋白的純化

SDS-PAGE考馬斯亮藍染色可見經包涵體洗滌、復性，GST親和層析柱純化后的PGEX-5X-BFRF3重組蛋白帶，相對分子質量為44 kD，純度達90%，見圖5。將純化后的抗原倍比稀釋后包被聚丙乙烯板條，以EBV陽性和陰性血清為標準，檢測GST/BFRF3重組融合蛋白的效價，發現GST/BFRF3重組融合蛋白的效價為1∶51 200。

Figure 4. Western blotting analysis of recombinant protein identified by GST polyclonal antibody.1. the total protein of induced PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3)；2. The total protein of induced PGEX-5X-1/BL21(DE3).

圖4重組蛋白的Westernblotting分析

Figure 5. The purified recombinant protein detected by 12% SDS-PAGE. M: low molecular weight protein mar-ker; 1：the purified PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3) recombinant protein.

圖5純化重組蛋白的SDS-PAGE分析

5BFRF3-IgA的檢測

用純化后的GST/BFRF3蛋白作為包被抗原分別對鼻咽癌患者及健康體檢標本進行檢測，結果如表1(通過ROC曲線確定其cut-off值)，在NPC患者和健康對照中，陽性率分別為65%和13%。北京貝爾生物工程有限公司 EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒檢測相同組別的NPC患者和健康對照，陽性率分別為64%和10%，與GST/BFRF3-IgA的檢測差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 GST/BFRF3-IgA和EBV VCA-IgA 試劑盒檢測NPC患者和健康人群結果的比較

6特異度評價

用BFRF3重組蛋白制備的IgA抗體試劑檢測297份EBV PCR陰性標本未出現陽性結果；在75份EBV PCR陽性標本中，有20份BFRF3-IgA檢測陽性。陽性結果均出現在EBV PCR 陽性的標本中，抗體檢測相對于核酸檢測的特異度為100%。單純皰疹病毒I型、II型IgM、IgG抗體陽性血清21份中，BFRF3-IgA檢測未出現陽性；巨細胞病毒IgM、IgG抗體陽性血清27份中，BFRF3-IgA檢測也未見陽性。

討 論

NPC在我國是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，EBV感染與NPC的發生發展密切相關。NPC的顯著特征是病人血清中的EBV VCA抗體(尤其是IgAs亞型)水平普遍升高，借此可區分NPC和健康攜帶者。這種血清學變化在NPC發病前期將先于癥狀出現，因此，EBV VCA-IgA抗體的檢測可用于NPC的早期診斷和流行病學調查。目前國內外EBV的血清學檢測采用免疫熒光法、免疫酶法和酶聯免疫吸附分析法等[6-8]。免疫熒光法因操作繁瑣、特異性差且需特殊儀器，已被逐漸淘汰；免疫酶法涂片細胞表達抗原因載量不穩定、陽性細胞計數受主觀因素影響等缺點，使得試劑的批間差異大，不同檢驗人員得出的結果也存在較大差異。因此人們試圖以ELISA方法取代免疫熒光法和免疫酶法用于大規模血清流行病學調查，但受抗原來源和純化方法的限制，無法獲得足夠的抗原用以大規模篩查，因此有必要利用DNA重組技術在不同表達系統中高效表達EBV相關抗原制備診斷試劑[9]。

VCA是NPC的重要診斷抗原，由病毒核衣殼和完整病毒顆粒包膜的多肽組成。p18是VCA的主要抗原多肽之一，由EBV基因組中BFRF3基因編碼，有極強的免疫原性,是檢測EBV VCA 相關抗體的主要抗原。本研究采用原核表達系統構建表達BFRF3基因并對其在NPC免疫檢測中的意義進行分析，希望能得到一個針對NPC患者VCA 特異性抗體的良好抗原。

大腸桿菌表達系統已成為外源基因的首選表達系統[10-11]，它具有遺傳背景清楚、成本低廉、高生產率、操作簡單、容易培養等優點。近年來出現的重組大腸桿菌的高密度發酵技術，不僅可以提高菌體的發酵密度，減少培養體積還可以縮短生產周期、降低生產成本，從而極大地提高了大腸桿菌表達系統在生產基因工程產品市場上的競爭力。本研究采用原核表達載體PGEX-5X-1對目的蛋白進行表達，由于PGEX-5X-1帶有GST純化標簽，所表達的融合蛋白產物可通過GST層析柱快速、簡便地純化，也可以通過凝血酶、x因子等切割后快速釋放，為生產高純度高活性的基因工程產品創造了有利條件。

BFRF3片段與其它單純皰疹病毒沒有同源性，其主要表位集中在BFRF3第119～176氨基酸區域內，在NPC病人的診斷和監控中具有一定價值。我們在大腸桿菌中表達了BFRF3全長片段，所獲得的GST/BFRF3融合蛋白主要以不溶性包涵體形式存在。通過洗滌包涵體、變性溶解、復性、GST親和層析等過程，得到了純度達90%以上的重組融合蛋白。GST/BFRF3融合蛋白的相對分子量為44 kD，Western blotting證實該蛋白有免疫原性，ELISA檢測的效價顯示了表達產物與NPC病人血清間具有良好的免疫反應性。將經GST親和層析柱純化后的GST/BFRF3重組蛋白，包被聚丙乙烯反應板，與辣根過氧化物酶標記的抗人IgA抗體配對，制備ELISA試劑，對NPC的病人和健康人群EBV IgA抗體進行檢測，發現在NPC病人中，陽性率為65%，與van Grunsven等[12]對香港NPC人群的研究結果相似(61%)。同時與北京貝爾生物工程有限公司EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒相比，其對NPC檢測的相對靈敏度及特異度二者無顯著差異。本研究在大腸桿菌中成功表達了GST/BFRF3融合蛋白，與本實驗室前期使用酵母系統表達的BFRF3重組蛋白在NPC人群中的陽性率(71%)無明顯差異，由于前期研究中酵母表達的BFRF3重組蛋白在轉為發酵罐進行大量培養時，表達的BFRF3重組蛋白活性與產率卻均過低，所以我們期望使用重組大腸桿菌的高密度發酵技術能夠大量制備有活性的GST/BFRF3重組蛋白。GST/BFRF3重組蛋白在NPC中的陽性檢出率為65%，仍無法滿足篩選所有NPC患者的需要，目前尚未發現任何單個血清學標志物可以用來診斷所有的NPC患者?？赡軐τ贓BV基因重組抗原來說，需要將不同抗原進行聯合檢測，才能提高NPC早期診斷的靈敏度和特異度。但具體需與哪種抗原片段進行聯合檢測，還有待于進一步探討。

本實驗用EB病毒PCR陽性和陰性血清、同屬皰疹病毒科的單純皰疹病毒抗體陽性標本及巨細胞病毒抗體陽性標本對BFRF3作為檢測抗原的特異度進行評價，陽性結果均出現在EB病毒PCR陽性血清中，在EBV PCR陰性標本、單純皰疹病毒抗體陽性標本和巨細胞病毒抗體陽性標本中均未出現陽性，證明BFRF3用于EBV IgA抗體檢測時，具有較高的特異度。

總之，本研究采用原核系統成功構建表達了GST/BFRF3重組融合蛋白，并對其在NPC血清學中的診斷價值進行了初步評估，表明BFRF3重組蛋白可以有效地用于NPC患者相關抗體的檢測，為尋找理想的基因工程EBV抗原用于制備NPC診斷試劑奠定了基礎。

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ProkaryoticexpressionandpreparationofGST/BFRF3fusionproteinofEpstein-Barrvirusforscreeningnasopharyngealcarcinomas

HU Bo1, CHEN Zhong-cheng1, WANG Dong-ning2, LI Lin1

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lilin5786@263.net)

AIM: To construct a prokaryotic expression plasmid containing Epstein-Barr viral (EBV) capsid antigenBFRF3 gene and to observe the application of recombinant BFRF3 protein in the serological diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).METHODSDNA extracted from the B95-8 cells was used as the templates. Polymerase chain reaction (PCR) was used to generate a DNA fragment ofBFRF3 gene, and a 531-bp DNA fragment was inserted into a PGEX-5X-1 vector. The recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 (DE3). The expression of GST/BFRF3 fusion protein was induced by IPTG, identified by both SDS-PAGE and Western blotting, and then purified by glutathione-sepharose beads. The purified recombinant protein was coated to microplate for ELISA detection of EBV-IgA antibody in NPC patients.RESULTSThe GST/BFRF3 fusion protein was successfully expressed inE.coli. The molecular weight of the product was approximately 44 kD. The recombinant fusion protein GST/BFRF3 showed good immunoreactivity. A novel ELISA was established using GST/BFRF3 protein. Serum samples collected from the NPC patients and healthy controls were tested by this ELISA. The sensitivity and specificity of GST/BFRF3 tests for NPC patients were 65% and 87%, respectively.CONCLUSIONThe recombinant protein GST/BFRF3 is expressed inE.coli, and it has diagnostic value for screening of NPC patients.

Nasopharyngeal neoplasms; Epstein-Barr viral capsid antigen; Prokaryotic expression

R365

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.033

1000- 4718(2013)06- 1147- 06

2013- 01- 24

2013- 05- 09

教育部第44批留學回國人員科研啟動基金[教外司留(2012)940]

△通訊作者 Tel： 020-85252885； E-mail： lilin5786@263.net