喉癌組織中的microRNA差異表達譜及miR-125a-5p抑制喉癌細胞增殖的初步研究*

張思毅， 盧仲明， 宋新漢， 張鴻彬， 陳良嗣， 羅小寧， 陳少華， 吳一龍

( 1南方醫科大學，廣東 廣州 510515; 2廣東省人民醫院,廣東省醫學科學院耳鼻咽喉頭頸外科, 3廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080)

喉癌組織中的microRNA差異表達譜及miR-125a-5p抑制喉癌細胞增殖的初步研究*

張思毅1,2△， 盧仲明1,2， 宋新漢2， 張鴻彬2， 陳良嗣2， 羅小寧2， 陳少華2， 吳一龍3△

(1南方醫科大學，廣東 廣州 510515;2廣東省人民醫院,廣東省醫學科學院耳鼻咽喉頭頸外科,3廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080)

目的篩選并分析喉癌組織與周圍正常喉黏膜的微小RNA(microRNAs，miRNAs) 之間的表達譜差異，為進一步研究miRNA與喉癌發生、發展的關系提供線索。方法收集喉癌組織和癌旁正常喉黏膜標本共42對，隨機選取10對標本進行miRNA微陣列基因芯片分析, 另選取32對標本進行實時熒光定量PCR (qRT-PCR)驗證，獲得喉癌組織中的miRNA差異表達譜。應用MTT法和克隆形成實驗檢測miR-125a-5p對喉癌Hep2細胞增殖的影響。結果喉癌組織中的let-7f-5p、miR-10a-5p、miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-195-5p、miR-203等6個miRNA在基因芯片以及qRT-PCR中表達均顯著下調。與對照組相比，轉染miR-125a-mimics組的喉癌Hep2細胞增殖能力受到抑制，而轉染miR-125a-inhibitor組Hep2細胞增殖能力增強。結論基因芯片與qRT-PCR結果一致；喉癌與正常喉黏膜之間存在明顯的miRNA差異表達，這些miRNA的差異性表達可能與喉癌的發病、侵襲等相關。miR-125a可以抑制喉癌Hep2細胞的增殖，可能作為喉癌生物治療的新靶點。

喉腫瘤； 微小RNA； 微陣列芯片； 細胞增殖

頭頸腫瘤是危及人類生命的主要癌癥之一，在所有癌癥中發病率居第6位。喉癌是最常見的頭頸腫瘤之一，在呼吸道腫瘤中發病率居第2位，絕大多數為鱗狀細胞癌。有國內外調查表明，喉癌的發病率不斷升高，每年約增加25%[1-2]，2008年世界上男性喉癌發病率估計為5.1/100 000，男性病人死亡率約為2.2/100 000。根據最新的研究，雖然近30年來新的外科手術方法、化療藥物及更先進的放射治療手段已應用在喉癌的治療中，與其它頭頸癌一樣，喉癌患者的總生存率并未得到提高，甚至有所下降[3]。流行病學調查發現喉癌的可能病因包括吸煙、酗酒、空氣污染、職業因素等[4-5]等。盡管有研究表明，喉癌的發生發展與某些癌基因(如bcl-2、c-myc等)和抑癌基因(如p53、Rb、p16、p21等)相關，但喉癌的分子水平發病機制目前仍未明確，因此目前還難以從分子機制干預喉癌的發病并提高其生存率。

微小RNAs (microRNAs, miRNAs)是一類長度大約19～25 nt小分子非編碼RNA。它主要通過與靶基因3’非翻譯區(3’ untranslated region ,3’UTR)的完全或不完全配對，降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，在轉錄后對靶基因的表達水平進行調控，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動[6-7]。近年研究提示， miRNAs 可能作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移和血管生成的基因調控中扮演了重要角色[8-9]，并可能與喉癌等頭頸腫瘤的發生、發展相關[10]，提示miRNA可能作為喉癌的生物標記物或治療靶標在喉癌的早期診斷、治療、預后等方面具有潛在的臨床價值。

然而，迄今為止，對喉癌中miRNA的差異表達情況尚未完全闡明。本研究采用涵蓋了miRbase數據庫中全部人類microRNA的第6代miRCURYTMLNA微陣列芯片，對喉癌中的miRNA差異表達進行初步篩選，通過實時定量PCR對其進行驗證，并初步地研究了miR-125a-5p(原名miR-125a)對喉癌Hep2細胞增殖的影響。旨在為進一步研究miRNA與喉癌發生、發展的關系提供線索，以便更好地了解喉癌分子水平的發病機制。

材 料 和 方 法

1組織標本采集與臨床資料的收集

收集2007年10月～2009年3月廣東省人民醫院手術切除的喉癌組織及癌旁正常組織共42對：術中分別切取經病理證實的喉癌組織及距離手術陰性切緣至少2 cm的正常喉黏膜各約0.5 cm3，標本經適量生理鹽水漂洗后迅速存入RNA later液(Qiagen公司)中保存，并于-80℃ 冰箱中保存。42例喉癌患者的臨床病理資料見表1，所有患者術后病理診斷均為鱗狀細胞癌，術前均未接受放、化療。將其隨機分為2組：10對喉癌標本進行microRNA芯片檢測，另32對標本進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗證。

表1喉癌病人臨床病理資料

Table 1. Clinicopathological characteristics of the laryngeal carcinoma patients (n=42)

ItemDataAge(year.Mean±SD)59.8±11.7Sex[n(%)] Male39(92.9) Female3(7.1)Type[n(%)] Supraglottic12(28.6) Glottic28(66.7) Subglottic2(4.8)Clinicalstage[n(%)] I19(45.2) II8(19.0) III2(4.8) IV13(31.0)Tstage[n(%)] T119(45.2) T210(23.8) T35(11.9) T48(19.1)Nstage[n(%)] N033(78.6) N1～39(21.4)Differentiation[n(%)] Poorlydifferentiated3(7.1) Moderatelydifferentiated23(54.8) Highlydifferentiated16(38.1)

2總RNA抽提及驗證

應用Invitrogen公司的Trizol和Qiagen公司的miRNeasy mini kit試劑盒抽提總RNA，按照說明書操作，覆蓋了各種RNA，包括miRNAs。使用Nanodrop公司的分光光度計ND-1000測定RNA的質量和定量，RNA的完整性由凝膠電泳判定。

3MicroRNA基因芯片檢測分析

隨機選取10對喉癌標本的總RNA進行以下microRNA芯片檢測。

3.1對RNA進行熒光標記和芯片雜交 抽提RNA后，使用丹麥Exiqon公司的miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit，按說明書進行miRNA標記。在熒光標記后，Hy3TM標記的樣品按手冊在miRCURYTMLNA 16.0 (Exiqon)芯片進行雜交。

3.2清洗掃描及信號數字化處理 MicroRNA芯片雜交后，用洗脫緩沖液(Exiqon)洗數次后400 r/min離心5 min干燥。用Axon GenePix 4000B microarray scanner (Axon)進行掃描。

掃描得到的圖像輸入GenePix Pro 6.0(Axon)軟件進行坐標調整和數據提取。重復的miRNAs數據取均數，選出在所有樣品中強度均≥50 的miRNAs計算標準化因子。表達數據使用中位數標準化，顯著差異表達的miRNAs通過火山圖(Volcano Plot)過濾后確認。使用MEV 4.6軟件(TIGR) 進行聚類分析。

4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

另取32對喉癌組織及癌旁正常黏膜組織標本，提取總RNA。采用SYBR Green染料法，以U6為內參照，對微陣列芯片結果中的6個miRNA: let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p和miRNA-203在各樣品中的表達量進行qRT-PCR驗證。

4.1逆轉錄 32對組織抽提總RNA后，取2 ng～2 μg總RNA用MMLV-RT逆轉錄酶按照說明合成cDNA：在總RNA中加入所有莖環結構的RT引物(廣州銳博生物公司合成)，用無RNA酶水補足至24 μL，混勻，70 ℃溫育10 min后冰浴2 min。依次加入RNA酶抑制劑2 μL、5×M-MLV Buffer 8 μL、RTase M-MLV(RNase H-)2 μL，dNTP Mixture 2 μL ，用無RNA酶水補足至40 μL， 30 ℃反應10 min，再42 ℃孵育1 h，最后70 ℃保溫15 min，獲得逆轉錄產物作為PCR模板。

4.2定量PCR 反應在Bio-Rad的熒光定量PCR 儀上進行擴增, 每組設3個復孔。反應體系為20 μL總體系：2× Mix SYBR Green I熒光反應液10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL，樣品模板1 μL，用無RNA酶水補足20 μL體系。反應條件為: 95 ℃ 預變性20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,70 ℃ 10 s，共40個循環，繪制擴增曲線；40個循環后對60 ℃到95 ℃升溫整個過程進行全程熒光信號收集，繪制熔解曲線。反應結束得到各反應管循環閾值(threshold cycle, Ct)。對獲得的Ct值采用2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量。

5細胞培養

5.1細胞株、培養基及相關試劑、儀器 喉癌Hep2細胞(購自ATCC收藏中心)；RPMI-1640基礎培養基(Gibco)；RPMI-1640完全培養基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；37 ℃細胞培養箱(Thermo)。 3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二甲苯基溴化四氮唑(MTT;Sigma)，5 g/L；二甲亞砜(DMSO;Sigma)，酶標儀(Bio-Rad)，96孔板和6孔板(康寧)，蘇木素(上海宏基)，脫色搖床(Qilinbeier)。

5.2細胞瞬時轉染 轉染前24 h消化和計數細胞，在6孔板的每孔中接種4×105個細胞，待細胞達到70%～80%匯合進行轉染；將Hep2細胞分別與miR-125a-mimic、miR-125a-inhibitor和陰性對照混合，置于250 μL無血清的基礎培養基Opti-MEM中，加入4 μL FuGENE?6 Transfection Reagent，混勻，室溫放置15 min；吸棄細胞培養物中的完全培養基，用基礎培養基Opti-MEM漂洗細胞2次，加入無血清基礎培養基Opti-MEM 1.5 mL；將DNA-FuGENE?6 Transfection Reagent復合物加入細胞中，前后輕晃6孔板使混合液分散均勻。6 h后吸棄轉染復合物，換入含10%胎牛血清的新鮮培養基。

5.3MTT實驗 用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞收集到含血清的培養基中。離心細胞懸液，重懸細胞，計數。將細胞稀釋至(0.5～1)×107/L，每個孔加入200 μL細胞懸液，每種細胞分4份分別種于4個96孔板，每份細胞3復孔，細胞培養箱中繼續培養。第1、3、5、7 d時，分別取出1個96孔板進行檢測。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃濕潤環境中溫育4 h。棄去孔中的培養基和MTT，加入150 μL DMSO，水平搖床低速混合10 min。酶標儀490 nm處記錄吸光度(A)。將1、3、5、7 d測得的A值匯總，繪制各組細胞的生長曲線。

5.4克隆形成實驗 收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度5×105cells/L，分于6孔板，每孔2 mL，即1 000 cells/well。培養7～10 d，觀察克隆出現日期及生長情況，大于50個細胞的集落算1個克隆。PBS洗3次，加固定液甲醇1 mL/well搖床上放置10 min。加入1 mL/well蘇木素放置搖床上10 min染色，倒掉蘇木素。計數每個孔的克隆數并拍照，計算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆數/接種細胞數×100%。

6統計學處理

MicroRNA基因芯片實驗結果采用芯片顯著性分析軟件(significance analysis of microarrays, SAM)進行分析, 設定錯誤發現率(false discovery rate, FDR)為0.05，篩選出喉癌組織和癌旁組織之間差異表達的microRNA。用SPSS 13.0軟件分析，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗。數據以均數±標準差(mean±SD)表示,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1總RNA提取質量分析

經分光光度計檢測，所有樣本提取的總RNA的A260/A280均在1.9～2.1之間；瓊脂糖凝膠電泳：28S和18S的RNA呈現明顯、銳利的條帶，而且28S帶熒光強于18S，二者之比約為2∶1。結果表明樣品總RNA的質量可靠、未降解，可用于后續實驗。

2miRNA基因芯片結果

我們通過miRNA芯片篩選得到了2 662個差異表達的miRNA，將其中的非人類miRNA以及超過一半樣本無法檢測到的miRNA去除后，比較了780個miRNA，采用SAM軟件分析, 設定FDR為0.05，發現相對正常黏膜, 在腫瘤組織中共有11個miRNA表達顯著上調； 114個miRNA表達顯著下調，見圖1、2。

3qRT-PCR驗證結果

對let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個miRNA進行qRT-PCR驗證，這6個miRNA在32對喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達差異均有統計學意義(P<0.05)。miRNA定量PCR溶解曲線均為單一峰，說明PCR擴增特異性好。我們再將芯片結果與qRT-PCR結果進行比較，結果顯示這6個miRNA表達均下調，miRNA芯片與qRT-PCR的結果相符,見圖3。

Figure 1. Heatmap of miRNA microarray in laryngeal squamous-cell carcinoma. Hierarchical clustering of differentially expressed miRNAs are shown in paired tumor-normal samples. Tissue samples are represented in columns, and differentially expressed miRNAs are delineated in rows. Red:up-regulation; green: down-regulation.

圖1喉鱗狀細胞癌miRNA微陣列芯片熱點圖

Figure 2. Significant miRNA genes identified using SAM analysis. From this analysis, there were 11 genes highly expressed and 114 genes lowly expressed in laryngeal cancer.

圖2通過SAM軟件分析獲得的顯著差異的miRNA基因

Figure 3. Comparison of the fold change for qRT-PCR and microarray data for selected miRNAs. Both miRNA microarray and qRT-PCR showed that the expression of let-7f-5p,miR-10a-5p,miR-125a-5p,miR-144-3p,miR-195-5p and miR-203 were down-regulated in laryngeal cancer tissue.

圖3選定的6個miRNAs的qRT-PCR與微陣列芯片結果比較

4MTT實驗結果

MTT實驗結果顯示,喉癌Hep2細胞轉染miR-125a-mimics、 miR-125a-inhibitor及陰性對照(NC)后，與NC組相比，轉染miR-125a-5p-mimics組活細胞數量顯著降低(第1 d：P<0.05；第3、5、7 d：P<0.01)，Hep2細胞增殖能力受到抑制；而轉染miR-125a-inhibitor活細胞數量顯著增加，細胞增殖能力明顯增強(第1 d：P<0.05；第3、5、7 d：P<0.01),見圖4。

5克隆形成實驗結果

細胞克隆形成實驗結果顯示：轉染miR-125a-mimics組Hep2細胞克隆形成率[(7.6± 0.9)%]顯著低于NC組的克隆形成率[(17.5±0.9)%](P<0.01)；而轉染miR-125a-inhibitor組的克隆形成率[(21.4±0.8)%]顯著高于NC組的克隆形成率[(10.0± 0.7)%](P<0.01)。這說明miR-125a-5p 表達對喉癌Hep2細胞的增殖能力有顯著抑制作用,見圖5。

Figure 4. MTT assays. A：up-regulation of miR-125a suppressed cell growth of human epidermoid carcinoma cell line Hep2; B：inhibition of miR-125a promotes cell growth of human epidermoid carcinoma cell line Hep2. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control (NC).

圖4MTT實驗檢測喉癌Hep2細胞分別轉染miR-125a-mimics和miR-125a-inhibitor后增殖能力的變化

討 論

在本研究中我們總共應用了42對新鮮冰凍喉癌組織及癌旁正常組織標本，其中10對標本采用丹麥Exiqon公司的第6代miRCURYTMLNA 16.0芯片進行分析，獲得了喉癌及其癌旁正常黏膜組織中miRNA的全基因表達譜，使用SAM軟件找到與喉癌相關的差異具有統計學意義的特征性miRNA。并進一步對另外32對標本應用莖環引物的熒光定量PCR技術進行驗證，發現了let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個miRNA在基因芯片以及qRT-PCR中均顯著下調。qRT-PCR與芯片結果一致，說明了本實驗基因芯片結果的可靠性。本研究還通過MTT和克隆形成實驗發現了miRNA-125a-5p可抑制喉癌Hep2細胞增殖，其可能成為喉癌生物治療的新靶點。

Figure 5. Colony-forming assay (crystal violet staining).A：Hep2 cells were transiently transfected with miR-125-mimics or scrambled sequence oligonucleotide as negative control (NC). Colony-forming assay showed a decrease in cell colony numbers relative to NC.B：Hep2 cells transfected with miR-125-inhibitor showed an increase in cell colony numbers relative to NC.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖5克隆形成實驗檢測miR-125a-5p表達對喉癌細胞Hep2增殖能力的影響

微陣列芯片技術是研究miRNA表達譜的重要手段。目前已發現的人類miRNAs有近2 000種(http://www.mirbase.org)，對數量如此龐大的miRNAs進行分析研究，需要高效率、高通量的檢測技術。miRNA微陣列芯片技術與傳統RNA分析方法比較，具有明顯優勢: (1)高通量，可以同時檢測上千個miRNA； (2)靈敏度和效率高； (3)樣本需要量小:僅需1 μg總RNA即可完成所有檢測。我們的研究應用了具有高靈敏度和特異性、最新版本的含有1 890個miRNA探針、可檢測目前miRbase數據庫中全部microRNA的miRCURYTMLNA 16.0 microRNA微陣列芯片進行檢測，盡可能地保證了結果的可靠性和準確性。

qRT-PCR 被廣泛認為是包括miRNA在內的核酸定量檢測的金標準[11]。由于目前miRNA微陣列芯片結果仍存在一定的假陽性，經其篩選所得的差異表達的miRNA一般仍需要進一步驗證。目前最常用于驗證在微陣列基因芯片等高通量實驗技術中發現的特異性miRNA。 Chen等[12]發明的莖環結構的實時定量PCR(stem-loop RT-PCR)因具有簡便、高敏感、高特異等特點已成為目前miRNA定量檢測法的推薦的qRT-PCR方法。實時定量PCR的結果一般應用2-ΔΔCt法進行相對定量計算miRNA的表達水平[13]。

目前miRNA在喉癌表達譜的研究仍存在諸多不足之處：多為頭頸鱗癌的研究，單純喉癌研究很少。雖然頭頸部各種腫瘤的發病部位相近，然而，喉部作為呼吸系統的一部分，與口腔、咽部等所屬的消化系統有所不同[14- 15]。喉癌與口腔癌、口咽癌、下咽癌等頭頸鱗癌有著不同的臨床病理特征及預后，例如喉癌病人的性別構成中男性發病比例明顯較其它頭頸腫瘤高[15]。而且，有喉癌與其它頭頸鱗癌的基因組雜交比較研究發現，兩者的染色體型存在明顯差異[16]。所以，不區分部位地對頭頸鱗癌一起進行研究可能會影響實驗結果的可靠性并帶來偏倚。此外，現有多數研究的標本量較小；不同研究結果間存在差異；一些研究使用石蠟包埋組織(在固定和包埋過程中可降解或者發生嚴重的交聯,故結果可能不如新鮮冰凍組織準確)；不少研究僅進行基因芯片檢測，未進一步進行實時熒光定量PCR驗證等均可能對研究結果帶來一定影響。

在我們的喉癌miRNA差異表達譜研究結果中，有miRNA-10a-5p[17]、miRNA-125a-5p[10]、miRNA-203[18]、miRNA-144-3p[19]等 microRNA與以往的頭頸鱗癌的文獻報道一致。其中miRNA-125a-5p[10]、miRNA-203[18]和miRNA-144-3p 3個miRNA在文獻中僅進行基因芯片檢測的miRNA，我們對其進一步進行了qRT-PCR驗證,而且在細胞水平初步研究了miRNA-125a-5p對喉癌Hep2細胞的增殖的影響。

同時我們也發現了一些尚未在頭頸鱗癌或喉癌研究中報道的或結果不一致的microRNA，如let-7f-5p、miR-195-5p。Let-7是最早在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)中發現的miRNA之一，包括多個家族成員，如let-7a、b、c、d、e、f。有研究認為let-7i在頭頸鱗癌中高表達[10]，而let-7a、c、e低表達[17]。在我們的研究中喉癌組織的Let-7f-5p呈低表達，與Tran等[20]的研究(Let-7f-5p為高表達)相反，這可能是因為Tran的研究是對舌、扁桃體、下咽、喉等多種頭頸腫瘤細胞株進行芯片檢測，而且沒有對Let-7f進行驗證；而我們的研究則選用新鮮冰凍喉癌組織進行研究，而且進行了qRT-PCR驗證。這也進一步證明了對喉癌等單病種而非多部位的不同頭頸腫瘤合并研究的優勢。miR-195是microRNA-15/16/195/424/497家族的重要成員，在肝癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、慢性淋巴細胞性白血病等多種腫瘤中均存在異常的表達下調[21]，提示miR-195可能是一個重要的腫瘤抑制因子。我們的研究首次發現，在喉癌中miR-195可能同樣存在異常的低表達，但仍需要細胞水平的研究以進一步證實。

本研究首次通過基因芯片和qRT-PCR技術證實了miRNA-125a-5p在喉癌組織中表達下調，并在細胞水平初步研究了miRNA-125a-5p對喉癌Hep2細胞的增殖的影響, 轉染miR-125a-mimics組細胞增殖能力受到抑制，而miR-125a-inhibitor促進其增殖能力。張帥等[22]研究表明，miRNA-125等miRNAs可能通過調控一些癌基因和抑癌基因(bcl-2、p53等)參與了去甲斑蝥素促進慢性髓細胞性白血病K562細胞凋亡的過程。還有研究顯示，miR-125a在肝癌組織和細胞株中均表達下調，并與侵襲性的病理學特征相關，上調miR-125a可通過抑制基質金屬蛋白酶11和血管內皮生長因子顯著抑制肝癌細胞的惡性表型[23]，提示了其成為腫瘤的有效治療手段和預后標志物的潛力。

[1] Jaseviciene L, Gurevicius R, Obelenis V, et al. Trends in laryngeal cancer incidence in Lithuania: a future perspective[J]. Int J Occup Med Environ Health,2004,17(4):473-477.

[2] 盧善婷，魏礦榮, 余炳輝，等. 中山市1970年～1999年喉癌發病趨勢分析[J]. 現代腫瘤醫學,2004,12(2):158-160.

[3] Hoffman HT, Porter K, Karnell LH, et al. Laryngeal cancer in the United States: changes in demographics, patterns of care, and survival[J]. Laryngoscope,2006,116(9 Pt 2 Suppl 111):1-13.

[4] Hashibe M, Boffetta P, Zaridze D, et al. Contribution of tobacco and alcohol to the high rates of squamous cell carcinoma of the supraglottis and glottis in Central Europe[J]. Am J Epidemiol,2007,165(7):814-820.

[5] Shangina O, Brennan P, Szeszenia-Dabrowska N, et al. Occupational exposure and laryngeal and hypopharyngeal cancer risk in central and eastern Europe[J]. Am J Epidemiol,2006,164(4):367-375.

[6] Croce CM, Calin GA. miRNAs, cancer, and stem cell division[J]. Cell,2005,122(1):6-7.

[7] Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature,2004,431(7006):350-355.

[8] Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs: microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[9] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer,2006,6(11):857-866.

[10]Ramdas L, Giri U, Ashorn CL, et al. miRNA expression profiles in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent normal tissue[J]. Head Neck,2009,31(5):642-654.

[11]Schmittgen TD, Lee EJ, Jiang J, et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA[J]. Methods,2008,44(1):31-38.

[12]Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res,2005,33(20):e179.

[13]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[14]Almadori G, Bussu F, Paludettii G. Predictive factors of neck metastases in laryngeal squamous cell carcinoma. Towards an integrated clinico-molecular classification[J]. Acta Otorhinolaryngol Ital,2006,26(6):326-334.

[15]Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2006[J]. CA Cancer J Clin,2006,56(2):106-130.

[16]Huang Q, Yu GP, Mccormick SA, et al. Genetic differences detected by comparative genomic hybridization in head and neck squamous cell carcinomas from different tumor sites: construction of oncogenetic trees for tumor progression[J]. Genes Chromosomes Cancer,2002,34(2):224-233.

[17]Hui AB, Lenarduzzi M, Krushel T, et al. Comprehensive microRNA profiling for head and neck squamous cell carcinomas[J]. Clin Cancer Res,2010,16(4):1129-1139.

[18]鐘 琦，房居高，黃志剛，等. 喉鱗狀細胞癌組織miRNA表達的初步研究[J]. 中華腫瘤防治雜志,2010,17(14):1073-1076.

[19]王 蘋，付 濤，王緒銳，等. 應用微陣列芯片分析喉鱗狀細胞癌miRNA與正常黏膜表達差異的初步研究[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2010,24(12):535-538.

[20]Tran N, Mclean T, Zhang X, et al. MicroRNA expression profiles in head and neck cancer cell lines[J]. Biochem Biophys Res Commun,2007,358(1):12-17.

[21]He JF, Luo YM, Wan XH, et al. Biogenesis of miRNA-195 and its role in biogenesis, the cell cycle, and apoptosis[J]. J Biochem Mol Toxicol,2011,25(6):404-408.

[22]張 帥，李有杰，張 超，等. miRNA在去甲斑蝥素致K562細胞凋亡中的作用研究[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(3):499-503.

[23]Bi Q, Tang S, Xia L, et al. Ectopic expression of miR-125a inhibits the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting MMP11 and VEGF[J]. PLoS One,2012,7(6):e40169.

DifferentialmicroRNAexpressionprofileinlaryngealcancerandeffectofmiR-125a-5ponproliferationoflaryngealcancercellline

ZHANG Si-yi1,2, LU Zhong-ming1,2, SONG Xin-han2, ZHANG Hong-bin2, CHEN Liang-si2, LUO Xiao-ning2, CHEN Shao-hua2, WU Yi-long3

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,3GuangdongLungCancerInstitute,GuangdongGeneralHospital&GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:syylwu@live.cn;szhang555@hotmail.com)

AIM: To investigate the differential microRNA expression profiles between laryngeal cancer and adjacent normal laryngeal mucosa.METHODSForty two pairs of laryngeal cancer tissue and adjacent normal laryngeal mucosa tissue were collected. Ten pairs of samples were used for determining microRNA expression by the method of miRNA microarray chip. Data analysis was performed to find out the significant differential microRNA expression profile in laryngeal cancer, and the difference was verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis on another 32 pairs of samples. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and colony-forming assay were used to analyze the proliferation of Hep2 cells induced by miR-125a-5p.RESULTSBoth miRNA microarray and qRT-PCR showed that the expression of let-7f-5p, miR-10a-5p, miR-125a-5p, miR-144-3p, miR-195-5p and miR-203 was down-regulated in laryngeal cancer tissues. miR-125a-5p suppressed the proliferation of Hep2 cells.CONCLUSIONThe results of microarray are accordant with those of qRT-PCR. Significant difference of miRNA expression profiles between laryngeal cancer and adjacent normal laryngeal mucosa indicates that miRNAs may play a role in carcinogenesis and progression of laryngeal cancer. miR-125a-5p inhibits the proliferation of Hep2 cell, indicating a novel therapeutic target against laryngeal cancer.

Laryngeal neoplasms; MicroRNA; Microarray chip; Cell proliferation

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.014

1000- 4718(2013)01- 0086- 07

2012-09-24

2012-11-19

廣東省科技計劃(No.2011B031800148)；2011年第二批省級財政產業技術研究與開發專項資金(No.Z012011254)

△ 通訊作者 吳一龍 Tel: 020-83827812；E-mail: syylwu@live.cn； 張思毅 Tel: 020-83827812；E-mail: szhang555@hotmail.com