黃芪多糖通過活化AMPK和促進骨骼肌FAT/CD36轉位改善成肌細胞FFAs代謝*

胡陽黔， 李 靜， 劉 堅， 歐陽靜萍， 宋 杰△

(1湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北 十堰 442000； 2湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000； 3武漢大學醫學院，湖北 武漢 430079)

黃芪多糖通過活化AMPK和促進骨骼肌FAT/CD36轉位改善成肌細胞FFAs代謝*

胡陽黔1， 李 靜2， 劉 堅2， 歐陽靜萍3， 宋 杰1△

(1湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北 十堰 442000；2湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000；3武漢大學醫學院，湖北 武漢 430079)

目的探討黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides, APS)對骨骼肌游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)代謝的影響及其機制。方法培養小鼠C2C12成肌細胞；MTT法檢測不同濃度FFAs作用不同時間對細胞活性的影響。根據MTT結果選取FFAs最適濃度和時間處理細胞并用APS干預，采用乙酰輔酶A合成酶-乙酰輔酶A氧化酶法檢測APS干預前后培養液FFAs濃度；Western blotting測APS干預前后細胞膜脂肪酸轉位酶(FAT/CD36)、總FAT/CD36、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase, p-AMPK)和總AMPK蛋白表達。結果FFAs對細胞的毒性呈濃度和時間依賴性。與FFAs組比較，FFAs+APS組細胞膜FAT/CD36及p-AMPK蛋白表達增加(P<0.05)，而總FAT/CD36及總AMPK蛋白表達無明顯差異(P>0.05),同時培養液FFAs濃度降低，細胞活性增加(P<0.05)。結論APS可以增加骨骼肌細胞對FFAs的攝取利用，其機制可能與活化AMPK和促進FAT/CD36轉位有關。

黃芪多糖； 游離脂肪酸； 腺苷酸活化蛋白激酶

目前研究認為血漿游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)升高是引起胰島素抵抗的主要因素之一[1]。骨骼肌是游離脂肪酸攝取及胰島素抵抗發生的重要部位[2]。越來越多的證據表明FFAs通過干擾胰島素的作用、抑制葡萄糖代謝而導致胰島素抵抗，所以針對FFAs代謝可以提供一條很有前途的改善胰島素抵抗和治療2型糖尿病的途徑。本實驗室毛先晴等[3]研究證實黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides, APS)治療可明顯改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗。本研究在上述背景基礎上，就骨骼肌細胞對FFAs的代謝以及應用黃芪多糖進行干預，探討黃芪多糖對骨骼肌FFAs代謝的影響以及可能機制。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

小鼠C2C12成肌細胞購自ATCC；低糖DMEM購自Sigma；優化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80～120 kD)(湖北中醫學院藥用植物鑒定教研室鑒定)[4]；MTT和AMPK抑制劑compound C購自Sigma；游離脂肪酸檢測試劑盒購自Wako；AMPKα Antibody購自Cell Signaling Technology； p-AMPK 抗體購自Upstate；脂肪酸轉位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)抗體購自Santa Cruz；長鏈游離脂肪酸(oleate∶palmitate=2∶1)購自Sigma。

2細胞傳代和培養

C2C12成肌細胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。

3實驗分組

取對數生長期的細胞，倒出培養液，用無菌的緩沖液沖洗3次，0.25%胰酶消化，然后計數每個培養瓶的細胞密度，以1×109/L轉入新的培養瓶。測FFAs作用時間分以下時間組：0、24 h、48 h和72 h；測FFAs作用濃度分以下濃度組：0、0.25、0.5和0.75 mmol/L。測培養液FFAs濃度變化、AMPK、p-AMPK及FAT/CD36表達情況，如下分組： (1)control組； (2)APS組，APS(200 mg/L)干預細胞24 h； (3)FFAs組， 0.25mmol/L FFAs干預細胞24 h；(4) FFAs+APS組， 0.25 mmol/L FFAs及APS(200 mg/L)共同干預細胞24 h； (5)FFAs+APS+compound C組，compound C+FFAs+APS共同干預細胞24 h。

4主要方法

4.1MTT實驗 (1)取生長良好的細胞，以濃度2×107/L的細胞懸液接種96孔培養板中，培養12 h細胞貼壁后，吸棄培養液，按實驗分組加入相應培養液繼續培養。(2)在24 h的前4 h各取培養板1塊，每孔加入濃度為5 g/L MTT 50 μL，繼續培養4 h后，吸棄上清液后向每孔加入20% DMSO 100 μL，振蕩后在酶標儀上以490 nm波長測吸光度(A)。

4.2Western blotting檢測 將處理后的細胞裂解后，置4 ℃采用超速離心法分離提取總蛋白及胞膜蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS-PAGE分離蛋白后，轉印到PVDF膜上，封閉、漂洗后加入Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋，KPL公司)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細胞測量程序的圖形分析軟件系統測出相對吸光度值。

4.3培養液游離脂肪酸濃度測定 按試劑盒說明書步驟采用乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)-乙酰輔酶A氧化酶(acetyl-CoA oxidase,ACOD)法測定。將培養液放置室溫，用自動加樣器移取10 μL；加入400 μL發色試劑A；5 min后，加入200 μL發色劑B；10 min后，測定吸光度，主波長546 nm，副波長660 nm。FFAs濃度測定由全自動生化儀完成，單位用mmol/L表示。

5統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，并采用SPSS 13.0統計軟件處理，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

10.25mmol/LFFAs作用不同時間對C2C12細胞活性的影響

0.25 mmol/L FFAs作用不同時間(24、48和72 h)，各組細胞活性均明顯低于control組，隨著FFAs作用時間的延長，細胞活性逐漸降低，見表1。

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vs24 h.

2不同濃度FFAs作用24h對C2C12細胞活性的影響

不同濃度FFAs作用細胞24 h，各組細胞活性均明顯低于對照組，隨著FFAs作用濃度的增加，細胞活性逐漸降低，見表2。

30.25mmol/LFFAs與APS共同作用24h對C2C12細胞活性的影響

APS組與對照組差異無顯著(P>0.05)。FFAs+APS組細胞活性明顯高于FFAs組(P<0.05)，FFAs+APS+compound C組細胞活性與FFAs組比無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表2不同濃度FFAs作用24h對C2C12細胞活性的影響

Table 2. The effects of different oncentrations of FFAs on viability of C2C12 myoblasts for 24 h (mean±SD.n=8)

Group0h24hControl0.817±0.0150.838±0.0470.25mmol/LFFAs0.814±0.0240.404±0.032△0.5mmol/LFFAs0.813±0.0430.212±0.047△▲0.75mmol/LFFAs0.825±0.0330.105±0.037△▲

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vs0.25 mmol/L FFAs.

表3APS對FFAs導致C2C12細胞活性變化的影響

Table 3. The effects of APS on FFA-induced viability changes of C2C12 myoblasts (mean±SD.n=8)

Group0h24hControl0.832±0.0150.821±0.024APS0.821±0.0770.833±0.019FFAs0.825±0.0770.414±0.040△FFAs+APS0.845±0.0690.775±0.046▲FFAs+APS+compoundC0.831±0.0250.423±0.057

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vsFFAs.

4培養液游離脂肪酸濃度測定

FFAs+APS組培養液FFAs濃度明顯低于FFAs組(P<0.05)，FFAs+APS+compound C組培養液濃度與FFAs組無顯著差異(P>0.05)。APS組及對照組按分組需要未加入FFAs處理,見表4。

表4APS干預對培養液中FFAs濃度的影響

Table 4. The effects of APS on the concentration of FFAs in the culture medium (mmol/L.Mean±SD.n=8)

Group0h24hControl00APS00FFAs0.250±0.0560.231±0.053FFAs+APS0.255±0.0410.134±0.023△FFAs+APS+compoundC0.261±0.0350.227±0.039

△P<0.05vsFFAs.

5AMPK、p-AMPK和FAT/CD36的表達

圖1顯示，各組總AMPK表達無顯著差異(P>0.05)；FFAs組p-AMPK較對照組顯著降低(P<0.05)；而FFAs+APS組p-AMPK較FFAs組顯著增加(P<0.05)；FFAs+APS+compound C組p-AMPK與FFAs組相比無顯著差異(P>0.05)。各組總FAT/CD36表達無顯著差異(P>0.05)；FFAs組細胞膜FAT/CD36表達較對照組顯著降低(P<0.05)；而FFAs+APS組細胞膜FAT/CD36表達較FFAs組和FFAs+APS+compound C組顯著增加(P<0.05)。

Figure 1. The expression of FAT/CD36, AMPK and p-AMPK proteins. C: control group; A: APS group; F: FFAs group; F+A: FFAs+APS group; F+A+CC: FFAs+APS+compound C group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC;▲P<0.05vsF or F+A+CC.

圖1FAT/CD36、AMPK和p-AMPK蛋白的表達

討 論

FFAs是引起胰島素抵抗的最主要非激素物質之一, 這已經為大量流行病學資料所證實。現代醫學研究表明, 在眾多心血管疾病的危險因素中胰島素抵抗處于核心地位, 或者說胰島素抵抗是滋生多種代謝相關疾病的共同土壤。

無論是對STZ誘導的2型糖尿病動物模型，還是遺傳性2型糖尿病模型(KKAy小鼠)或胰島素抵抗模型，APS都具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量、降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用[5-7]。

本研究通過培養小鼠C2C12成肌細胞，采用不同濃度FFAs作用持續不同時間，發現FFAs對C2C12細胞的毒性呈濃度和時間依賴性：FFAs濃度越高、作用時間越長，細胞活性越低。FFAs采用了接近于臨床、更有利于反映病人實際的濃度(0.25 mmol/L)；為保證細胞的最佳活性，選取24 h作為FFAs的干預時間。與FFAs組比較，FFAs與APS共同作用于細胞后細胞活性明顯增加。國內外已經證實FFAs增高可導致三羧酸循環減慢和枸櫞酸聚集，反饋調節而使糖氧化受到抑制、糖攝取減少、酯化增強、脂解減弱，進而導致脂質在細胞內蓄積和能量供應短缺。FFAs組的細胞活性下降可能與此有關。而后續的實驗證實，FFAs+APS組中APS可以促進FFAs的攝取和氧化，增強脂解，為細胞提供能量，從而改善了細胞活性。

為進一步研究APS對C2C12細胞游離脂肪酸攝取的影響及其機制,我們采用上述濃度的FFAs處理細胞，用APS進行干預，發現APS可以促進C2C12細胞對FFAs的攝取。對于上述機制的探索，我們注意到近年較受關注的FAT/CD36。FAT/CD36廣泛分布在心臟、小腸、骨骼肌、脂肪等組織，它對脂肪酸的轉運具有重要作用。胞漿內的FAT/CD36不能有效轉運長鏈脂肪酸。FAT/CD36從細胞內庫轉位到細胞膜是肌細胞攝取脂肪酸的重要調節機制[8]。本研究證實高FFAs抑制FAT/CD36由細胞內庫向細胞膜轉位，從而不利于能源物質攝取。Western blotting結果證實APS可增加高FFAs狀態下骨骼肌細胞FAT/CD36由細胞內庫向細胞膜轉位。這可能是APS促進FFAs攝取的機制。

隨后我們進一步研究了APS促進FAT/CD36轉位機制。我們先前研究發現APS可以活化AMPK[9]。Luiken等[10]研究發現，用AMPK的激活劑AICAR刺激心肌細胞可以增加脂肪酸的攝取，同時還發現FAT/CD36轉位到細胞膜上的含量增加。Chabowski等[11]研究發現，用AICAR長期刺激心肌細胞后，FAT/CD36的mRNA和蛋白水平均顯著增加。Pandke等[12]使用AMPK的激動劑β-胍基丙酸作用于心肌細胞后，其FAT/CD36的總蛋白及膜蛋白顯著增加。在本研究中，通過比較分析FFAs+APS+ compound C組與FFAs+APS組蛋白表達情況，說明在AMPK抑制劑存在的情況下，APS活化AMPK的通路被阻斷，進而APS促進FAT/CD36轉位的作用被抑制,證實APS是通過活化AMPK進而促進FAT/CD36向細胞膜轉位，從而增加FFAs的攝取。而AMPK活化后促進FAT/CD36向細胞膜轉位的機制目前尚不清楚，需要我們繼續研究。

在我們先前研究中[9]還發現，在高FFAs處理24 h后的C2C12細胞，APS可以活化AMPK進而抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，從而促進FFAs氧化分解，減少FFAs在細胞內蓄積，同時為細胞提供能量。FFAs在細胞內蓄積可導致細胞毒性，APS減輕脂質在細胞內蓄積的作用具有重要的意義，它可能是APS減輕FFAs細胞毒性的重要機制。上述兩方面研究證實,APS活化AMPK不僅可以增加FFAs攝取，而且可以促進進入細胞的FFAs氧化分解，為細胞提供能量，從而改善細胞脂代謝和細胞活性。

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APSimprovesfreefattyacidmetabolismbyactivatingAMPKandpromotingtranslocationofFAT/CD36inC2C12myoblasts

HU Yang-qian1, LI Jing2, LIU Jian2, OU-YANG Jing-ping3, SONG Jie1

(1DongfengAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;2HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;3MedicalSchoolofWuhanUniversity,Wuhan430079,China.E-mail:doctorsongjie@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragaluspolysaccharides (APS) on the metabolism of free fatty acids (FFAs) in C2C12 myoblasts.METHODSCultured C2C12 myoblasts were used in the study. The viability of C2C12 myoblasts treated with FFAs at different concentrations for different time was observed by MTT assay. The concentrations of FFAs in the medium were detected by acetyl-CoA synthase (ACS)-acetyl-CoA oxidase (ACOD) method. The expression of fatty acid translocase (FAT/CD36), AMPK and p-AMPK protein was examined by Western blotting.RESULTSFFAs decreased the viability of C2C12 myoblasts in a time- and concentration-dependent manner. Compared with FFAs group, the expression of cellular membrane FAT/CD36 and p-AMPK proteins increased in FFAs+APS group, but total AMPK and FAT/CD36 protein expression was not significantly changed. Meanwhile, the concentration of FFAs in the medium decreased and the cell viability increased in FFAs+APS group as compared with the group.CONCLUSIONAPS improves the metabolism of FFAs by activating AMPK and promoting translocation of FAT/CD36 in C2C12 myoblasts.

Astragaluspolysaccharides; Free fatty acids; AMP-activated protein kinases

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.011

1000- 4718(2013)04- 0637- 04

2012- 10- 08

2013- 03- 01

國家自然科學基金資助項目(No.30370673; No.30770734); 十堰市科技局科技項目(No.ZD2012037)

△通訊作者 Tel： 0719-8272543； E-mail： doctorsongjie@163.com