VEGF-165-GMs復合自體顆粒骨修復兔陳舊性橈骨缺損的實驗研究

吳少科 曾榮 郭偉韜 鐘環 譚宏昌 胡資兵 魏勁松 魏波 康毅

·論著·

VEGF-165-GMs復合自體顆粒骨修復兔陳舊性橈骨缺損的實驗研究

吳少科 曾榮 郭偉韜 鐘環 譚宏昌 胡資兵 魏勁松 魏波 康毅

目的 探討VEGF-165-GMs復合自體顆粒骨修復兔陳舊性橈骨缺損的效果。方法 24只新西蘭大白兔雙側橈骨均建立1.5 cm的陳舊性骨缺損實驗模型, 隨機分為A、B、C三組, A組植入自體顆粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；B組植入200 mg自體顆粒骨；C組 VEGF-165-GMs 1 mg；分別于術后3、6、9周切取標本,通過X線攝片、骨密度測量、生物力學測試、組織形態學觀察等手段,觀察各個時期新骨形成的情況。結果 A、B組均能較好地修復陳舊性骨缺損, A組術后各時間點X線評分、骨密度測量、生物力學測試、組織形態學觀察均明顯優于B組。C組各時間點均無骨性愈合跡象, 9周時可見骨斷端完全硬化, 髓腔封閉。結論 VEGF-165-GMs復合自體顆粒骨修復陳舊性骨缺損可以明顯促進局部血運重建, 促進新生骨形成, 提高骨改建塑形的速度和質量。

血管內皮生長因子-165；自體顆粒骨 ；陳舊性橈骨缺損；骨修復

由于自體骨移植無免疫排斥反應, 組織相容性好, 生物學潛能大, 骨誘導和傳導作用強, 是骨缺損治療的“金標準”。移植骨在植入人體后能否發揮最大作用, 很大程度取決于其與宿主的血運重新建立, 移植骨的血管化是骨修復的關鍵環節, 因此早期建立有效血供對提高自體骨移植的療效有著重要意義。血管內皮生長因子-165(Vasular endothelial growth factor-165,VEGF-165)通過與血管內皮細胞膜上受體結合,具有強大特異性促血管內皮細胞增生和血管生成作用, 是促進血管再生的最后通道。本實驗探討應用自體顆粒骨復合VEGF修復陳舊性骨缺損的能力, 為臨床應用提供理論依據。并考慮到VEGF在局部代謝快、作用不持久的問題, 決定將VEGF-165制成緩釋載體(Vasular endothelial growth factor-165-gelatinmierospheres, VEGF-165-GMs), 從而為進一步應用于骨組織工程研究提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器 新西蘭大白兔24只(48條橈骨)(廣東醫學院實驗動物中心提供), 體重2.5～2.8 kg；VEGF-165 (Pepro Tech北京博蕾德生物有限公司分裝) ；雙能X線密度儀( GE Lunar Prodigy 暨南大學附屬醫院核醫學科)；生物力學試驗機(MTS 858 Mini Bionix南方醫科大學生物力學實驗室)

1.2 VEGF-165-GMs制備 采用改良的雙相乳化冷凝交聯法制備明膠微球［1］, 并檢測明膠微球的物理性質, 以及結合和體外緩釋VEGF-165性能和規律(另文發表)。證實VEGF-165明膠緩釋微球有良好的藥物包封、緩釋功能,VEGF-165-GMs載藥率為0.2%。

1.3 VEGF-165-GM復合自體顆粒骨修復兔陳舊性橈骨缺損 參照文獻報道制作兔橈骨陳舊性骨缺損模型［2］并隨機分為三組：A組(9只18條前臂)：植入200 mg自體顆粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；s B組(9只18條前臂):植入200 mg自體顆粒骨；C組(6只12條前臂):植入VEGF-165-GMs 1 mg。

手術方法：①在按前文所述建造的兔陳舊性骨缺損模型上, 于雙側橈骨原切口入將骨折端硬化部分連同纖維瘢痕組織一并切除, 將閉鎖的髓腔開放, 經處理后的骨缺損段長1.5 cm ；②取一側自體髂骨塊在冰鹽水中用磨鉆磨成顆粒骨,離心收集；③A組植入200 mg自體顆粒骨, 1 mg VEGF-165-GMs充分混合, 形成復合物, 用內徑0.6 cm、長1.5 cm管狀物塑形后植于骨缺損部位；B組植入200 mg自體顆粒骨混合物；C組植入植入塑形的1mg VEGF-165-GMs；④ 逐層縫合切口。分為術后3、6、9周三個時間點觀察,A、B組各時間點隨機處死3只兔, C組各時間點各處死隨機2只兔。

1.4 檢測項目及方法 (1)X線觀察 行動物雙側前肢X線正位片檢查, 評估各時間點的骨形成及骨塑性構建情況。(2) 骨密度檢查: 取6、9周兔橈骨利用雙能X線骨密度儀小動物用骨密度測量軟件檢測包括骨缺損區在內橈骨中段2．0cm骨密度。(3)生物力學檢查: 取6、9周標本進行橈骨三點彎曲試驗。(4)病理組織學: 在普通光學顯微鏡下觀察骨缺損修復及顆粒骨與周圍骨質融合情況。

1.5 統計學分析 統計學檢驗實驗數據用SPSS13.0 for windows統計軟件分析, 計量資料用均數±標準差(x-±s)表示, P＜0.05為差異有統計學意義。若方差齊性, 采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)進行檢驗, 用LSD法進行多重比較；若方差不齊, 用Welch近似方差分析法進行檢驗,用Dunnett’s T3法進行多重比較, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 X線攝片檢查結果 A、B組3周時均可見植入物云霧樣改變, 與宿骨間有模糊骨痂形成, 但A組模糊影較大(見圖1.1)；6周時兩組的骨折線均消失, 骨缺損區骨形成充滿骨痂, A組髓腔部分再通, 皮質骨改建塑性, B組髓腔仍為骨痂填充, 未改建塑性(見圖1.2)；9周時, A、B組均有較滿意的骨修復效果, 但B組塑形效果較差, 髓腔僅部分相通(見圖1.3)。C組各時間點均無骨性愈合跡象(見圖1.4)。

圖1.1 A組3周X光

B組3周X光

圖1.2 A組6周X光

B組6周X光

圖1.3 A組9周X光

B組9周X光

圖1.4 C組X光

2.2 骨密度檢測 術后6周及9周A組骨密度值均大于B組,差異有統計學意義(P＜0.05), 各組9周骨密度均較6周時高,差異有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

表1 各時間點骨密度檢測(g/cm2 , x-±s)

2.3 生物力學測定 三點彎曲實驗中各時間點A組橈骨最大載荷均比B組大, 差異有統計學意(P＜0.05)；隨修復時間延長,骨骼質量增強, 組內比較有差異, 差異有統計學意義(P＜0.05)(見表 2)。

表2 三點彎曲實驗橈骨最大載荷檢測(N, x-±s)

三點彎曲橈骨位移橈度統計結果與最大載荷結果基本一致 (見表 3)。

表3 三點彎曲實驗橈骨位移橈度檢測(n=6, mm, x-±s)

2.4 組織學檢查 3周時A組顆粒骨融合并有大片新生骨形成, 移植顆粒骨間無成纖維細胞浸潤生長, 無死骨形成,顆粒骨與宿骨間融合生長, 新骨中有豐富的血管存在(圖2.1)。B組顆粒骨間有較多的成纖維細胞生長填充顆粒骨間,有散在深染的死骨形成(圖2.2)。6周A組顆粒骨融合成片狀,內部形成松質骨樣結構, 新骨中存在豐富的血管, 中板層樣結構開始出現雛形(見圖2.3)；B組顆粒骨間皮質骨尚未形成統一方向的骨板(見圖2.4)。9周時A組皮質骨、髓腔改建塑性完成, 有正常皮質, 骨髓腔形成, 內容正常的骨髓組織(圖2.5), B組髓腔亦形成, 但較為狹窄, 皮質骨未完全改建, 仍可見較多小血管穿行其中, 未形成致密的骨質(見2.6)。 C組組織學表現與陳舊性骨缺損表現相似, 6周時仍然見較多未分化間充質細胞及小血管, 成熟纖維細胞較少(見圖 2.7)。

圖2.1 A組3周顆粒骨與宿主骨融合(HE×40)

圖2.2 B組3周散在死骨形成(HE×40)

圖2.3 A組6周靠近骨膜部分改建形成與縱軸平行的骨板，骨髓樣組織形成。(HE×40)

圖2.5 A組9周改建基本完成(HE×40)

圖2.6 B組9周皮質骨正在改建塑形(HE×40)

圖2.7 未分化的間充質細胞和小血管(HE×100)

3 討論

血管生成是骨修復的前提和基礎, 沒有新生血管就沒有骨骼的修復, 這已成為共識。VEGF又稱血管通透因子,VEGF與血管內皮細胞膜上受體結合, 具有強大特異性促血管內皮細胞增生和血管成形作用, 是促進血管再生的最后通道［3］。有學者研究發現VEGF缺乏所導致動物骨不連病理變化與臨床骨不連病理改變極其相似, 從而判斷VEGF缺乏是骨不連發生的原因之一［4］。VEGF在骨再生和骨修復的作用已得到了更多的證實［5］,其主要通過促進局部新生血管形成［6］及引發成骨細胞的遷移、分化、增殖［7］等作用來增強骨缺損修復能力, 是許多調節骨的生長和改建生長因子中非常重要的一種。

本次實驗中實驗組移植骨存活率高、無死骨形成, 早期大量的新生軟骨形成, 顆粒骨間融合, 移植物與宿主骨整合等骨修復表現比對照組更優,其原因可能是緩釋的VEGF-165促進新生血管形成, 改善局部血運, 使移植骨保留其細胞活性直接促進骨修復, 同時帶入間充質骨細胞向成骨細胞方向分化, 形成新骨, 優于單純移植顆粒骨經歷的“爬行替代”過程。VEGF-165還可以通過血管內皮細胞來間接參與骨修復過程, Palazzini S等［8］發現新生的血管內皮細胞可以促進骨髓干細胞向成骨源性細胞方向分化, 在外源性VEGF-165作用下實驗組新生血管形成早、多, 進而觀察到后續骨痂形成較為規整, 新骨形成量多, 板層骨形成較早, 骨改建塑形所需的時間短, 其修復效果更佳、更快, 在后期X線評分及組織學檢查結果均優于對照組, 從側面證實了Palazzini S的觀點。

結果表明VEGF-165-GMs復合自體顆粒骨能增強顆粒骨血運重建, 提高移植骨的存活, 誘導新骨形成, 加快骨骼改建塑形, 從而促進骨修復。但具體的作用機制尚不明確,還需進一步的實驗研究探討, 所涉及的細胞信號途徑等一系列問題也有待后續的實驗研究加以明確。

［1］ 吳紅,吳道澄,于開濤,等.平陽霉素明膠微球的制備及其釋藥特性.生物醫學工程學雜志, 2003, 20(4): 646-649.

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［8］ Palazzini S, Palumbo C, Ferretti M,et al.Stromal cell structure and relationships in perimedullary spaces of chick embryo shaft bones.Anat Embryol (Berl) ,1998,197(5): 349-357.

Experiment on repairing obsolete radial defects in rabbits with the composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone

WU Shaoa-ke, ZENG Rong,GUO Wei-tao, et al.
Department of Orthopedics ,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhangjiang 524001,China

Objective To explore the effect about composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on the repairing obsolete radial defects in rabbits.Methods Make obsolete radial defect model on 24 rabbits’double radial,then randomly divided into A, B, C groups.A group treated with the compound of the VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on obsolete radial defects, B group treated with autogenous morselized bone only, C group treated with VEGF-165-GMs ; animals were put to death at different time points(3,6,9 week) to get the model, through X-ray imaging, bone density measure,biomechanics test, histology compare to understand the growth condition of new bone at different time points.Results A,B groups both active repair obsolete radial defects in rabbits.But A group reflected better in X-ray imaging, bone density measure ,biomechanics test, histology compare.C group has no synostosis at any time.In 9 week the broken ends of fractured bone to become complete sclerosis, and the canals of de Candolle were blockaged.Conclusion The composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone can distinguished enhance local revascularization, and promote neoplastic bone formation, improve the speed and quality of bone remodeling and bone moulding.

Vasular endothelial growth factor-165; Autogenous morselized bone ; Obsolete radial defects ;bone repair.

廣東省科技計劃項目(項目編號：2010B031600288)；湛江科技攻關計劃項目(項目編號：2012C3102030)

524023 湛江, 廣東醫學院附屬醫院骨科

E-mail：wushaoke@yahoo.cn