鹽酸阿撲嗎啡鼻噴劑微生物限度檢查方法的驗證

王連蘭 郭小紅

1 供試品、培養基、器材及菌種

1.1 供試品 鹽酸阿撲嗎啡鼻噴劑批號:110417由浙江濟民制藥股份有限公司提供(注:驗證試驗采用一批供試品三次獨立的平行試驗)

1.2 培養基 脂培養基(批號101130);玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號110808);改良馬丁培養基(批號1105242);改良馬丁瓊脂培養基(批號100622);膽鹽乳糖培養基(批號100031);營養肉湯培養基(批號100628);甘露醇氯化鈉培養基(批號100825);硫乙醇酸鹽流體培養基(批號110311);4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養基(批號:091029);麥康凱瓊脂培養基(批號100125);溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號:101005);稀釋液(沖洗液):pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號1105312);以上培養基、稀釋液均由北京三藥科技開發公司生產。

1.3 器材 HTY-2000A集菌儀;PY-330型號一次性使用集菌培養器(批號20110924);可拆卸式集菌儀培養器以上器材均由杭州泰林醫療器械有限公司提供。

1.4 驗證用微生物及其菌號 枯草芽胞桿菌CMCC(B)63501，金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003大腸埃希菌CMCC(B)44102，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，銅綠假單胞菌CMCC(B)10104

2 菌液制備［1］

2.1 取經30～35℃培養18～24 h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌的肉湯培養物1 ml加9 ml鹽水(0.9%無菌氯化鈉溶液)，10倍稀釋至10-7，細菌數約為10～100CFU/ml，做活菌計數備用。

2.2 經20～25℃培養24～48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物1 ml加9 ml鹽水(0.9%無菌氯化鈉溶液)，10倍稀釋至10-7，細菌數約為10～100CFU/ml，做活菌計數備用。

2.3 取經20～25℃培養5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養物，加3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，再用無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將菌懸液稀釋至每1 ml中含10～100CFU的孢子懸液，做活菌計數備用。采用中國藥典2010版提供的方法制備菌液，除黑曲霉菌液取10-5外，其余5種均取10-7的菌液。

3 方法及結果

中國藥典有關微生物限度檢查法方法驗證試驗［2］。

3.1 菌落計數(常規法)

3.1.1 供試液的制備 樣品10 ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，充分搖勻制成1:10的供試液。

3.1.2 試驗組 薄膜過濾法，取兩只已滅菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，再泵入20 ml上述供試液，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗濾膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中分別接入1 ml已制備好的菌液，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養基平板上培養。重復上述操作，做完其余的試驗菌。每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

3.1.3 供試品對照組 驗組的方法處理，不加菌液，菌面朝上貼于相應的培養基培養。

3.1.4 菌液組 1 ml上述制備的菌液，直接接種于平皿，加入相應的培養基培養。

3.1.5 稀釋劑對照組 直接以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，其余試驗操作同試驗組。

3.2 培養 營養瓊脂培養平皿倒置于30℃ ～35℃下培養3 d;將玫瑰紅鈉瓊脂培養平皿倒置于23℃ ～28℃下培養5 d。

3.3 觀察和計數 平皿逐日檢查計數，結果以培養終了時的計數方法為準，并將每組試驗中接有相同試驗菌株的2個平皿計數進行平均，取平均值。

表1 菌液組計數結果(CFU/ml)

表2 薄膜過濾法試驗組回收率(%)

表3 薄膜過濾法稀釋劑對照組回收率(%)

供試品對照組的細菌總數和霉菌總數均＜1個/g，根據以上結果:在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率和試驗組的菌回收率均大于70%。

4 控制菌檢查法

4.1 供試液的制備 同菌落計數法。

4.2 試驗組 采用薄膜過濾法，取兩只已滅菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，再泵入20 ml上述供試液，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗濾膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中加入已制備好的菌液(其中一管加入1 ml的大腸埃希菌菌液，另一管加入1 ml的銅綠假單胞菌菌液)。取出濾膜，分別放至100 ml的膽鹽乳糖培養基中。同以上操作，在最后一次淋洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液，取出濾膜，放至100 ml的硫乙醇酸鹽流體培養基。置30℃ ～35℃培養箱培養24～48 h。

4.3 陰性對照組 方法同試驗組，用金黃色葡萄球菌作為大腸埃希菌的陰性對照菌，用大腸埃希菌作為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的陰性對照菌。置30℃ ～35℃培養箱培養24～48 h。

4.4 結果 取接有大腸埃希菌的試驗組及其陰性對照組的培養物0.2 ml，分別接種至5 mlMUG培養管內，30℃ ～35℃培養箱培養5～24 h，取未接種的MUG培養管作本底對照，將各管置365nm紫外光燈下檢視，如有大腸埃希菌生長應呈現熒光，然后加數滴靛基質試液，結果見表4。

表4

取接有銅綠假單胞菌的試驗組及其陰性對照組的培養物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，30℃ ～35℃培養箱培養18～24 h。結果:試驗組菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色色素擴散。表示有典型的銅綠假單胞菌生長。陰性對照組沒有檢出銅綠假單胞菌。

取接有金黃色葡萄球菌的試驗組及其陰性對照組的培養物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，培養24～72 h。結果:試驗組菌落呈金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環，菌落直徑0.7～1 mm。表示有典型的金黃色葡萄球菌生長。陰性對照組沒有檢出金黃色葡萄球菌。

根據以上結果，本品控制菌檢查采用薄膜過濾法，培養基用量為100 ml。

5 小結

鹽酸阿撲嗎啡鼻噴劑的微生物限度檢查方法對微生物生長沒有抑制性影響。因此，此方法驗證通過。

［1］ 蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術.華齡出版社，2007:277-316.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典.(二部).中國醫藥科技出版社，2010:附錄 107-116.