小鼠生長(zhǎng)期下坡跑改善去卵巢后骨中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)和骨形成

陳祥和 ，李世昌 ，孫 朋 ，馬 濤 ，楊念恩 ，季 瀏

青春生長(zhǎng)期是骨生長(zhǎng)發(fā)育的第2個(gè)高峰期，也是影響峰值骨量的敏感時(shí)期，峰值骨量的50%是在該時(shí)期積累的[1]。Ⅰ型膠原蛋白既是骨的重要組成成分，也是很多影響因素發(fā)揮調(diào)控骨代謝生物學(xué)作用的主要位點(diǎn)[2]，其表達(dá)增加對(duì)于改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和增加骨量具有重要作用。與調(diào)控Ⅰ型膠原蛋白的Ⅰ型膠原α2（Collagen Type IAlpha 2，COL1α2）相比，Ⅰ型膠原α1（Collagen Type IAlpha 1，COL1α1）在調(diào)控Ⅰ型膠原蛋白合成過程中起著更為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在影響Ⅰ型膠原蛋白和骨量的眾多因素中，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練起到重要作用。然而，有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練調(diào)控骨中Ⅰ型膠原蛋白代謝的研究鮮有報(bào)道，尤其是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨的作用影響在停止訓(xùn)練后是否存在，仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。

本研究利用下坡跑運(yùn)動(dòng)模型對(duì)生長(zhǎng)期雌性小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，從不同層面上對(duì)以下2個(gè)假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證：（1）下坡跑可通過上調(diào)骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加骨量；（2）下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期小鼠骨中Ⅰ型膠原蛋白和骨形成所造成的影響在去卵巢一段時(shí)間后仍然存在。

1 研究材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4周齡C57 BL/6雌性小鼠80只，體重（15.08±1.89）g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2008-0016。將小鼠隨機(jī)分為安靜組（C組）、運(yùn)動(dòng)組（D組）、安靜去卵巢組（C+OVX組）、運(yùn)動(dòng)去卵巢組（D+OVX組）和安靜假手術(shù)組（C+SHAM組），每組16只。動(dòng)物訓(xùn)練和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)均在華東師范大學(xué)“青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所用C57BL/6小鼠從4周齡開始到13周齡結(jié)束，正處于小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育期（簡(jiǎn)稱生長(zhǎng)期）[3]。經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，D組和D+OVX組進(jìn)行下坡跑訓(xùn)練，跑臺(tái)坡度-9°，速度0.8 km/h，每周訓(xùn)練5次，每次40 min，共8周。C組、C+OVX組和C+SHAM組在籠中正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何訓(xùn)練。利用去卵巢后6周正常喂養(yǎng)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型[4]。

最后1次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，動(dòng)物以1%戊巴比妥鈉（0.1 g/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉后剪除脊柱兩側(cè)長(zhǎng)毛，分別在兩側(cè)切開1 cm切口，C+OVX組和D+OVX組進(jìn)行卵巢摘除手術(shù)，C+SHAM組進(jìn)行假手術(shù)，利用可吸收羊腸線縫合，傷口上涂抹少量紅霉素軟膏，術(shù)后靜養(yǎng)6周。

因此，本研究分為2部分：C組與D組的比較擬觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)骨Ⅰ型膠原蛋白合成表達(dá)、骨小梁結(jié)構(gòu)和骨量的影響；C+OVX、D+OVX和C+SHAM組的設(shè)立是為了驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)期小鼠骨所造成的影響是否在去卵巢一段時(shí)間后仍然存在。

1.3 取材

最后1次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，C組和D組小鼠斷頸椎處死，分別取2組小鼠右側(cè)股骨和脛骨（不保留軟組織），PBS溶液清洗后置于-80℃冰箱中保存，以備RT-PCR檢測(cè)骨中COL1α1 mRNA表達(dá)，同時(shí)利用電子天平（PL203，METTLERTOLEDO，上海）檢測(cè)股骨和脛骨總重，利用游標(biāo)卡尺分別檢測(cè)股骨和脛骨長(zhǎng)度；取左側(cè)脛骨，以備免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脛骨骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)；取2組剩余小鼠左側(cè)脛骨，以備硬組織切片檢測(cè)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)。去卵巢喂養(yǎng)6周結(jié)束后，斷頸椎處死剩余3組小鼠，取材步驟同上。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 骨組織中COL1α1 mRNA定量檢測(cè) 將存放于-80℃冰箱中的股骨和脛骨取出，提取RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟說明進(jìn)行RNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄，利用RT-PCR定量試劑盒對(duì)樣本中COL1α1 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)。從美國(guó)國(guó)家生物信息中心序列資料庫(kù)查找小鼠COL1α1和beta-actin全基因序列，COL1α1上游引物為 5′-GCGAGTGCTGTGCTTTCTG-3′，下游引物為 5′-GGACATCTGGGAAGCAAAGT-3′；beta-actin上游引物為 5′-CTCTTTTCCAGCCTTCCTTCT-3′，下游引物為 5′-TGGAA GGTGGACAGTGAGG-3′。利用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成。

1.4.2 脛骨骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白檢測(cè) 小鼠左側(cè)脛骨（去除軟組織）在4%PFA中固定12 h，進(jìn)行酒精梯度脫水（70%、80%、95%、100%），二甲苯透明，浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。修片后以6μm進(jìn)行切片，按照Envision二步法對(duì)石蠟切片骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)狀況進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)束后，于顯微鏡下進(jìn)行拍照（放大倍數(shù)×20）。

1.4.3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 小鼠左側(cè)脛骨4%PFA固定后，經(jīng)梯度酒精脫水，然后利用InfiltrationⅠ和Ⅱ進(jìn)行浸潤(rùn)，進(jìn)行樹脂包埋，包埋好后進(jìn)行硬組織切片。按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行骨小梁Von Kossa染色，利用Osteomesure體視學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析脛骨干骺端骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.4 小鼠右側(cè)股骨、脛骨重量和長(zhǎng)度的檢測(cè) 取小鼠右側(cè)股骨和脛骨，利用電子稱測(cè)量其總重量，利用游標(biāo)卡尺從右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁至股骨頭頂端測(cè)量股骨長(zhǎng)度，測(cè)量左側(cè)脛骨內(nèi)踝至髁間隆起的長(zhǎng)度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各檢測(cè)結(jié)果均以Mean±SD表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為非常顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 研究結(jié)果

2.1 下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期及去卵巢后小鼠骨組織中COL1α1mRNA表達(dá)的影響

與C組相比，D組小鼠骨中COL1α1mRNA表達(dá)上調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；去卵巢6周后，與C+OVX組相比，D+OVX組小鼠骨中COL1α1 mRNA表達(dá)仍維持在較高水平且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與C+SHAM組相比，C+OVX組小鼠骨中COL1α1 mRNA表達(dá)下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見表1）。

?

2.2 下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期及去卵巢后小鼠骨中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

與C組相比，D組小鼠左側(cè)脛骨骨基質(zhì)中的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平更高；與C+OVX組相比，D+OVX組小鼠左側(cè)脛骨骨基質(zhì)中的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)仍維持在較高水平；去卵巢靜養(yǎng)6周后，與C+SHAM組相比，C+OVX組小鼠左側(cè)脛骨骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。

2.3 下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期和去卵巢后小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

與C組相比，D組小鼠骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）（P<0.05）和骨小梁厚度（Tb.Th）（P<0.01）升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骨小梁間隔（Tb.Sp）（P<0.01）下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。去卵巢6周后，與C+OVX組相比，D+OVX組 BV/TV（P<0.05）、Tb.Th（P<0.05）和 Tb.N（P<0.01）均維持在較高水平，且Tb.Sp（P<0.01）下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與C+SHAM組相比，C+OVX組 BV/TV（P＜0.05）、Tb.N（P<0.05）和Tb.Th（P<0.01）的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tb.Sp（P<0.01）的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

2.4 下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期和去卵巢小鼠骨重、股骨和脛骨長(zhǎng)結(jié)果

8周訓(xùn)練結(jié)束后，與C組相比，D組小鼠骨重（P<0.01）、股骨長(zhǎng)（P<0.05）和脛骨長(zhǎng)（P<0.05）的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；去卵巢6周后，與C+OVX組相比，D+OVX組小鼠骨重（P<0.05）仍然較高；與C+SHAM組相比，C+OVX組骨重降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見表 3）。

表3 下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期和去卵巢后小鼠骨重、股骨和脛骨長(zhǎng)度的影響（Mean±SD，n=8）Table3 Effects of downhill running on bone weight，femur and tibia length in growth and ovariectomized Mice（Mean±SD，n=8）

3 討論與分析

Ⅰ型膠原蛋白占骨中膠原蛋白總量的90%，作為編碼Ⅰ型膠原蛋白的COL1α1，其編碼異常會(huì)造成骨形成障礙[5]。在調(diào)控COL1α1編碼Ⅰ型膠原蛋白的眾多因素中，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練起著重要作用。LU等 研究證實(shí)，8周中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練可顯著上調(diào)小鼠骨中COL1α1 mRNA表達(dá)并編碼Ⅰ型膠原蛋白。BOSCH等[7]在其研究中也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可上調(diào)小馬駒骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，下坡跑可顯著上調(diào)骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，這與前人研究相一致。其機(jī)制可能與跑動(dòng)下落過程中，小鼠下肢骨受到較大的地面反作用力從而上調(diào)骨中TGF-β促進(jìn)其下游靶基因COL1α1 mRNA表達(dá)上調(diào)并編碼Ⅰ型膠原蛋白有關(guān)[8]。其作用效果在去卵巢一段時(shí)間后是否仍然存在呢？本研究顯示，下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期小鼠骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)所造成的影響在去卵巢6周后仍然存在。其原因可能是，去卵巢后仍存在力學(xué)刺激作用，一方面可通過抑制Rho和Rho激酶活性或HMG-CoA還原酶活性來上調(diào)骨中BMP-2mRNA表達(dá)，進(jìn)而通過Smads途徑來上調(diào)骨組織中COL1α1 mRNA表達(dá)，從而編碼Ⅰ型膠原蛋白[9]；另一方面，還可通過激活Wnt信號(hào)通路上調(diào)COL1α1 mRNA來編碼Ⅰ型膠原蛋白[10]。

骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)不但可定性分析骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化狀況，還可對(duì)骨小梁面積與厚度、骨小梁連接點(diǎn)數(shù)量、骨形成和骨吸收速率等骨組織微結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行定量分析，較客觀地反應(yīng)骨結(jié)構(gòu)和骨轉(zhuǎn)換的狀況[11]。ISAKSSON等[12]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期跑輪運(yùn)動(dòng)使小鼠骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯著改善。VICENTE等[13]研究發(fā)現(xiàn)，12周跑臺(tái)訓(xùn)練可顯著上調(diào)大鼠骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)從而改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本研究也發(fā)現(xiàn)，下坡跑訓(xùn)練使小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)顯著改善，表明，8周下坡跑訓(xùn)練可顯著改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而去卵巢后，小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)仍維持在較高水平，說明，下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)造成的影響在去卵巢后仍然存在，其機(jī)制可能與去卵巢后COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白仍然高表達(dá)有關(guān)。DING等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠骨中Ⅰ型膠原蛋白合成增加可改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由此推測(cè)，下坡跑引起的骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)改善可能與骨中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

骨代謝研究中，常將骨重和骨長(zhǎng)度等看作骨形成的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)[15]，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)生長(zhǎng)期骨形成代謝這已在很多研究中被證實(shí)。本研究也發(fā)現(xiàn)，下坡跑使得生長(zhǎng)期小鼠骨重、股骨及脛骨長(zhǎng)度均顯著增加，說明8周下坡跑可顯著促進(jìn)骨形成。其機(jī)制可能與骨中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加以及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)改善密切相關(guān)。GAUDIN-AUDRAIN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，骨中膠原蛋白合成增加可改善骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并使得骨重和骨長(zhǎng)度增加，去卵巢后，雌激素濃度下降可加快骨吸收，使得骨量和骨長(zhǎng)度降低。但本研究中，D+OVX組小鼠骨重仍較高，股骨和脛骨長(zhǎng)度雖無(wú)顯著性變化但均高于C+OVX組。表明，下坡跑對(duì)生長(zhǎng)期骨造成的影響在去卵巢后仍然存在，這與去卵巢后Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)以及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)各指標(biāo)仍較高密切相關(guān)。SHIMIZU等[17]研究證實(shí)，骨組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加有助于改善骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和增加骨重。由此推測(cè)，去卵巢后，小鼠骨重仍維持在較高水平可能與骨中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)仍較高以及較好的骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。

4 小 結(jié)

下坡跑可能通過上調(diào)骨中COL1α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)改善骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和骨量，且這種作用在去卵巢后仍然存在。

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