負載pcDNA3.1-EGFP殼聚糖納米顆粒的制備及其生物學特性分析

邵小青,陳 艷,陳 貝,陳澤燁,奚菊群,龔衛娟

(揚州大學醫學院,1.免疫學教研室;2.藥劑學教研室,江蘇揚州,225001)

“納米凝膠”(Nanogel)是能夠在水溶液中分散并具有納米尺寸的水凝膠顆粒,通常由物理或化學交聯的聚合物網絡結構所組成[1]。聚電解質納米凝膠可結合帶有相反電荷的小分子藥物、核酸類藥物及蛋白質,從而可用于制備新型納米藥物或基因疫苗。納米藥物還具有穩定性好、對胃腸刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、具有靶向性和緩釋功能等優點[2-4]米凝膠負載pcDNA3.1或其重組質粒后的生物學效應,本文制備并鑒定了殼聚糖納米凝膠負載pcDNA3.1-EGFP重組質粒的相關生物學特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖(脫乙酰度85%,Mv=200000)來自浙江玉環海洋生物有限公司,經本實驗室自行修飾為羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖,N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl]。 CT-26、RAW264.7細胞株來自美國ATCC公司。pcDNA3.1-EGFP質粒為本實驗室構建并保存[5]。體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司,質粒大量抽提試劑盒來自Qiagen公司,細胞數目檢測MTS/PMS試劑盒來自Promega公司,RPMI-1640培養基購自invitrogen公司,胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 負載質粒的殼聚糖納米顆粒制備:利用Qiagen公司大量質粒提取試劑盒,測定質粒的濃度和總量,調整濃度為1 mg/mL,殼聚糖濃度調整為 1 mg/mL。按1∶0.5,1∶1,1∶2質量比,總體積共設為1 mL。將質粒溶液滴加入殼聚糖中,300 rpm,室溫振蕩30 min,混合均勻。4℃離心機最大速度離心 20～25 min,徹底分離游離DNA和納米顆粒。

1.2.2 納米顆粒包封率測定:利用紫外分光光度計檢測上清中DNA濃度,并根據體積計算游離DNA量。納米顆粒包封率的計算公式為(質量總量-游離 DNA量)/質量總量 ×100。另外,利用DNA瓊脂糖電泳鑒定游離DNA的量。

1.2.3 納米顆粒粒徑及電位測定:利用激光動態光閃射儀檢測納米顆粒的粒徑大小,利用Zeta電位儀檢測樣品中納米顆粒的電荷狀況,每個樣品均掃描20次。

1.2.4 納米顆粒轉染細胞及熒光檢測:分別取小鼠巨噬細胞系RAW264.7和腸癌細胞系CT-26,用無血清DMEM洗滌接種24孔培養板。次日納米顆粒用DMEM稀釋為20%的濃度,分別加到細胞培養體系。6、16 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光細胞。并且于6、16 h消化細胞,流式細胞儀分析綠色熒光細胞的比例。另外,用商品化脂質體包裹相同量的質粒作為陽性對照,單純質粒溶液轉染作為陰性對照。

1.2.5 納米顆粒的細胞毒性分析:取對數期培養的RAW264.7和CT-26細胞,以每孔5000個細胞的數目加入96孔板內,每種納米顆粒設4個復孔。于24、72 h后每孔內加入20 μ L MTS/PMS試劑,1 h后利用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。

2 結 果

2.1 納米顆粒對pcDNA3.1-EGFP質粒的包封率

不同殼聚糖與質粒的質量比對納米顆粒的包封率產生直接影響。研究結果發現殼聚糖:質粒的質量比為1∶1時,納米顆粒的包封率最高,達到99%。而兩者質量比為1∶2時,納米顆粒的包封率最低(圖1)。取包封后液體的上清進行瓊脂糖電泳,僅在殼聚糖與質粒質量比為1∶2的液體中看到游離的DNA(圖2)。因此,當殼聚糖與質粒在液體中以合適比例混合、并適度振蕩后,可以高效率地包裹DNA質粒。

圖1 殼聚糖-pcDNA3.1-EGFP納米顆粒的包封率分析

圖2 殼聚糖包裹質粒體系上清的凝膠電泳結果

2.2 納米顆粒的大小及Zeta電位測定

取制備好的納米顆粒溶液,用激光動態光閃射儀檢測顆粒直徑,結果顯示3種不同的殼聚糖納米顆粒粒徑均分布在100～300 nm。用Zeta電位儀檢測納米顆粒的電荷,結果顯示三種顆粒均攜帶正電荷,范圍分布在40～100 mV(表1)。

表1 殼聚糖納米顆粒的粒徑及Zeta電位分布

2.3 細胞攝取納米顆粒的活性測定

將制備好的納米顆粒用無血清培養基稀釋后,轉染RAW264.7和CT-26細胞,6、16 h分別用熒光顯微鏡觀察熒光細胞。結果顯示,當加入納米顆粒6 h或16 h后,RAW264.7和CT-26細胞培養體系中均可觀察到熒光細胞(圖3,圖5)。并且在相同時間點,將兩種細胞消化、洗滌,采用流式細胞儀定量檢測熒光細胞頻率,結果顯示16 h綠色熒光細胞的頻率較6 h輕度升高(圖4,圖6)。

圖3 殼聚糖納米顆粒轉染RAW264.7細胞的熒光圖 (100倍)

圖4 流式細胞儀檢測殼聚糖納米顆粒轉染RAW264.7細胞后的表達效率

圖5 殼聚糖納米顆粒轉染CT-26細胞的熒光圖 (100倍)

圖6 流式細胞儀檢測殼聚糖納米顆粒轉染CT-26細胞后的表達效率

2.4 納米顆粒的細胞毒性檢測

為觀察納米顆粒體內運用時潛在的細胞毒性,將不同質量比制備的納米顆粒懸液分別與RAW264.7和CT-26細胞共培養,于 24、72 h利用MTS/PMS法檢測細胞培養孔內活細胞的數目,結果發現,與單獨培養基或單純質粒相比,納米顆粒對RAW264.7、CT-26細胞的生長無明顯影響(P>0.05),且不同方法制備的殼聚糖納米顆粒之間無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

本研究首先利用殼聚糖材料,制備運載重組基因表達載體的納米顆粒,初步檢測了納米顆粒的粒徑和電位。其次,將納米顆粒加入細胞培養體系,證實該負載熒光蛋白表達基因的納米顆粒可被細胞攝取、并在細胞內得到表達。最后發現這些殼聚糖納米顆粒對細胞的體外生長沒有明顯毒性。該研究結果說明本實驗所用的殼聚糖納米顆粒制備方法簡單、易行,還提示基于pcDNA3.1質粒載體構建的納米顆粒可被多種細胞攝取并表達,為利用納米材料運載基因疫苗提供直接的實驗依據。

腫瘤部位存在免疫細胞缺陷,其血管具有高滲透性,使得一定尺寸、大小和分子量的顆粒物具有非特異靶向性,這種非特異性的腫瘤富集現象稱為EPR效應(enhanced permeablity retention effect,EPR)[6]。因此通過納米顆粒運載特定藥物或基因,可具備一定的腫瘤靶向性。另外,通過將一些傳統藥物加以改造制成納米顆粒可以達到優化藥物特性的目的。比如將核苷類抗癌、抗腫瘤藥物連接到角鯊烯上,可以聚集成100～300 nm的納米顆粒,這將提高藥物的藥效和穩定性,降低腫瘤的抗藥性[7-8]。

利用天然陽離子多糖(殼聚糖)運載DNA,因其與帶負電荷的核酸分子結合作用很強,體內使用具有很好的生物降解性、生物相容性,較低的細胞毒性,價格也很低廉[9-10]。另一方面,殼聚糖納米顆粒運送DNA,可能存在胞漿內DNA釋放遲緩、不能逃離細胞內體(溶酶體)酶的作用,被降解而不能表達出目的產物的現象[11-12]。高分子量殼聚糖在生理pH狀態下容易聚集、黏稠度高而丟失在體內運送基因疫苗的可能性[13-14]。本研究中對殼聚糖進行羥丙基三甲基氯化銨修飾,使該材料在生理pH狀態下仍然保持很好的水溶性。另外,盡管我們制備的殼聚糖納米顆粒可被細胞攝取,但低于陽離子脂質體介導相同質量DNA轉染后的表達效率,提示可進一步改善納米顆粒制備條件,以獲得更好的細胞攝取率[15]。

綜上所述,本研究基于自行制備的羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖材料,成功制備負載pcDNA 3.1-EGFP表達載體的納米顆粒。其大小在100～300 nm,攜帶正電荷,被細胞有效攝取而表達出綠色熒光蛋白,并具有很好的生物安全性。該實驗結果對制備負載pcDNA3.1系列重組載體的納米顆粒,體內運送基因疫苗而治療腫瘤,提供了重要的參考依據。

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