骨橋蛋白在膽固醇結石患者膽囊黏膜上皮中的表達及意義

朱 斌,袁岱岳,邵偉斌,嚴棟梁,郝清亞

(江蘇省南通市第一人民醫院肝膽外科,江蘇南通,226001)

骨橋蛋白(OPN)是一種具有多種生物活性的酸性非膠原糖蛋白,最早從骨基質分離出來,具有鈣離子結合的特性[1]。現已證明OPN在泌尿系結石的發生中起重要作用[2],但關于其與膽結石形成的關系的研究與報道較少。本研究采用免疫組織化學方法檢測OPN在膽固醇結石患者和正常人的膽囊組織中的表達情況,探討OPN在膽囊膽固醇結石形成中的作用,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年7月—2012年10月本院普外科膽囊病理標本共35例,并分為結石組和非結石組。結石組共納入單純膽囊膽固醇結石患者25例,男 6例 ,女 19例,年齡 24～83歲,平均(41±9.7)歲,術后以病理診斷及膽囊結石剖面結構相結合作為診斷依據。非結石組納入因其他原因行膽囊切除的非膽囊結石患者的膽囊標本10例,男8例,女2例,年齡41～77歲,平均(52±8.6)歲,其中肝癌5例,胰腺癌 2例,肝外傷1例,膽囊挫裂傷1例,胃癌1例,病理診斷為正?；蚪咏Ｄ懩?表現為膽囊黏膜腺體無增生、萎縮、壞死脫落,沒有纖維脂肪組織增生,有少量或無炎性細胞浸潤。

1.2 試劑與實驗方法

鼠抗人OPN單克隆抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)工作濃度為1∶100。采用Elivision二步法進行染色。所用Elivison試劑盒(PV-9000)和DAB酶底物顯色(均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。具體步驟:石蠟組織行4 μ m厚度連續切片,經常規脫蠟水化后,其余操作按Elivison試劑盒說明書進行。以陽性膽囊癌切片做陽性對照,PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.3 結果判斷標準

對OPN陽性表達的評估采用半定量積分法,綜合陽性細胞的百分比及染色強度進行判斷。陽性細胞<5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。染色強度無著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。取陽性細胞百分比和染色強度兩項積分評分,0分為(-),1～4分為(+),5～8分為(2+),9～12分為(3+)。所有標本均由兩位經驗豐富的病理科醫師以雙盲法閱片。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件對結石組和對照組的數據進行統計學分析,進行Mann-Whitney U檢驗,計算出P值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

在OPN表達陽性的細胞內,見OPN集中表達于膽囊黏膜上皮細胞的胞質及管腔側,在脫落的膽囊黏膜上皮細胞中也有表達。OPN在結石組中多呈陽性或強陽性表達(圖1A),非結石組膽囊黏膜中呈弱陽性或陰性表達(圖2B)。經半定量分析,2組有顯著差異(P<0.05),見表1。

圖1 OPN在膽囊黏膜上皮細胞內的表達情況

表1 OPN在2組中的表達

3 討 論

OPN是一種非膠原性酸性骨基質糖蛋白,其分子內部含有包括一RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸),該序列通過與其受體avβ3整合蛋白結合參與鈣離子的代謝和組織的礦化,是促進細胞黏附的蛋白質中的特有結構[3-5]。OPN在消化系統的許多臟器都有表達,其中包括膽囊黏膜上皮及膽汁[1]。已證實OPN在泌尿系結石的形成和發展過程中有重要的作用,但是否有參與膽結石的形成,目前的研究報道較少。

本實驗通過免疫組化Elivision二步法,檢測OPN在單純膽囊膽固醇結石患者與非結石患者膽囊黏膜上皮內的表達。與Ichikawa H等的報道相似[6],作者發現OPN集中表達于膽囊黏膜上皮細胞的胞質及管腔側,在脫落的膽囊黏膜上皮細胞中也有表達,單純膽囊膽固醇結石組患者OPN的表達要顯著高于非結石組?，F已證實在膽固醇結石中含有大量的鈣鹽沉積和OPN的表達[1,6]。有學者從膽固醇結石患者的膽汁中分離到OPN的功能區域—鈣離子的結合位點RGD片段[6]。因此可以認為OPN從膽囊黏膜上皮分泌,最終被包裹在膽固醇結石的中心,提示OPN可能在膽固醇結石的形成過程中有著重要的作用。

OPN在小鼠、大鼠及人腎臟均有表達,主要位于亨利氏攀升枝和遠曲小管,這些部位是與尿石形成有關礦物質的高濃縮區[7]。草酸鈣晶體在腎小管上皮細胞腔面的黏附沉積對腎結石的形成起初始促進作用[3]。Lieske等報道,OPN可通過其RGD序列與草酸鈣晶體結合,來影響草酸鈣晶體與腎小管上皮細胞結合[8-9]。國內王瑩[10]用乙二醇誘導建立SD大鼠腎結石模型,發現從誘導第10天起腎結石組大鼠的OPN在遠曲小管的表達要顯著高于對照組。此結果與本研究OPN在單純膽囊膽固醇結石患者中表達結果相類似,因此作者設想OPN是否也通過類似影響泌尿系結石形成的機制影響膽結石的形成。

本研究提示OPN參與了膽固醇結石的形成,可能會為今后治療膽囊結石的診斷和治療提供一個新的靶點,但其具體的作用機制仍有待進一步研究解決。

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