RNA 干擾抑制NgR 表達(dá)對(duì)腦梗死大鼠皮質(zhì)脊髓束可塑性的影響

張小喬 李 鸝 陳 敏 霍江濤 潘慶敏 嚴(yán) 潔

與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷性疾病一樣，缺血性腦卒中后中樞神經(jīng)難以再生是導(dǎo)致偏癱等嚴(yán)重后遺癥的主要原因，如何促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前的研究表明，造成CNS損傷后缺乏再生能力的主要原因是CNS神經(jīng)元所生存的外部微環(huán)境中存在的髓磷脂相關(guān)抑制物的作用。現(xiàn)已確認(rèn)的中樞神經(jīng)髓鞘來源的主要抑制因子有以下三種：Nogo－A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白（MAG）和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白（OMgp），三者在CNS中分別由少突膠質(zhì)細(xì)胞和一些神經(jīng)元產(chǎn)生，存在于髓鞘的內(nèi)外環(huán)和少突膠質(zhì)細(xì)胞的表面，它們具有誘導(dǎo)生長錐塌陷和抑制軸突生長的功能，它們被證實(shí)與相同的神經(jīng)元受體NgR 結(jié)合而介導(dǎo)軸突再生抑制作用［1］。作為三個(gè)結(jié)構(gòu)不同的軸突生長抑制分子的共同受體，NgR 是提高CNS再生能力治療研究方面的重要突破口。本實(shí)驗(yàn)研究擬在制備缺血性腦梗死大鼠模型的基礎(chǔ)上選擇NgR 基因作為治療的靶點(diǎn)，利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)下調(diào)NgR 基因的表達(dá)，觀察其對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及皮質(zhì)脊髓束可塑性的影響，為腦缺血后神經(jīng)再生探索一種基于RNA 的藥物治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

質(zhì)粒pGenesil（武漢晶賽生物技術(shù)有限公司），生物素化葡聚糖胺（Biotinylated dextran amine，BDA）神 經(jīng) 示 蹤 試 劑 盒（Invitrogen 公 司），兔 抗GAP－43單克隆抗體（1：200稀釋）、山羊抗兔多克隆抗體（1：500稀釋）、兔鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物（strept－avidin－biotin complex，SABC）試劑盒（Sigma，USA），兔抗NgR IgG（Santa Cruz，USA），蛋白質(zhì)marker（Promega 公司），Western blot檢測(cè)試劑盒（Amersham 公司）；Olympus光學(xué)顯微鏡，HPIAS－1000型彩色計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包。

1.2 RNA 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Elbashir等的設(shè)計(jì)原則［2］，應(yīng)用BLOCK－iTTMRNAi Designer設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并選取了兩個(gè)分別對(duì)應(yīng)于NgR mRNA（GenBank accession No：NM＿053613）序列上468、1392 起始位點(diǎn)的siRNA作用靶序列（1：GCAGTACCTCTACCTACAAGA；2：GGTACTTTGGACAGTGCTTGG）及一個(gè)無 關(guān) 序 列（ACGACTGATACTATGGATACA），經(jīng)BLAST 分析該序列與大鼠其他基因無明顯同源性。化學(xué)合成編碼的shRNA 由21bp及BamHⅠ／HindⅢ位點(diǎn)粘末端堿基等組成的寡聚脫氧核糖核酸模板，連接至質(zhì)粒pGenesil 1中U6啟動(dòng)子下游BamHⅠ／H indⅢ位點(diǎn)，酶切鑒定后對(duì)U6啟動(dòng)子區(qū)和克隆序列區(qū)測(cè)序（武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司）。構(gòu)建所得兩種RNA 干擾質(zhì)粒和一種無關(guān)對(duì)照質(zhì)粒分別命名為pNgR－shRNA1、pNgR－shRNA2和pCon。用鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，挑取單克隆菌落進(jìn)行小量擴(kuò)增提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后再行大量擴(kuò)增（堿裂解法），硅藻土柱層析法純化，滅菌TE（pH 8.0）溶解后凍存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)

Sparague－Dawley健康成年雄性大鼠，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200～250 g，鼠齡12 W，隨機(jī)取18只大鼠作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。其余大鼠在制作局灶性腦梗死模型后隨機(jī)分為pNgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2組、pCon 組及模型組，每組各18 只。pNgRshRNA1組、pNgR－shRNA2 組、pCon 組 大 鼠 分 別在腦梗死后當(dāng)天大鼠蘇醒后于梗死側(cè)側(cè)腦室注射相應(yīng)的RNA 干擾質(zhì)粒（3 mg／kg），模型組不作處理。

1.4 局灶性腦梗死動(dòng)物模型制作

參照Zea Longa線栓法制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦梗死模型［3］。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg／kg體重）麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)頸正中稍偏左切口，分離、暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近段、頸外動(dòng)脈根部及分支，在頸總動(dòng)脈近分叉處剪一小口，經(jīng)此插入直徑0.20 mm頭端圓鈍的漁線，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處通過頸內(nèi)動(dòng)脈入顱至大腦中動(dòng)脈的起始部以阻斷大腦中動(dòng)脈血流，插入深度為（19.0±0.5）mm，結(jié)扎頸總動(dòng)脈，縫合皮膚。制模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)右側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；同側(cè)Horner征；爬行時(shí)向右劃圈；站立時(shí)右側(cè)傾倒。凡具有上述四項(xiàng)體征者列入研究對(duì)象。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)定

各組大鼠在腦梗死后第1、7、14 d應(yīng)用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified Neurological Severity Scores，mNSS）方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定［4］。神經(jīng)功能按受損嚴(yán)重程度分為0～18分，0分為正常，18分為最嚴(yán)重神經(jīng)功能缺失。mNSS 根據(jù)一系列的運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)分。每給1分表明大鼠不能完成規(guī)定的試驗(yàn)或反射，因此評(píng)分越高，表明神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。

1.6 組織標(biāo)本制備及免疫組化檢測(cè)梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)GAP－43的表達(dá)水平

各組取6只大鼠在腦梗死后第7d神經(jīng)功能評(píng)定結(jié)束后用過量的10%水合氯醛深度麻醉，開胸經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，先用100 ml生理鹽水快速?zèng)_洗血液，接著用4%多聚甲醛PBS 400 ml灌注固定，然后將大鼠斷頭取腦，置4%多聚甲醛中后固定過夜，之后石蠟包埋，行連續(xù)冠狀位切片。取相同層面的標(biāo)本行免疫組化SABC法檢測(cè)GAP－43表達(dá)水平：切片常規(guī)脫蠟至水后加入3%H2O2甲醇溶液，室溫10 min；加入正常山羊血清封閉，室溫20 min；然后分別加入兔抗GAP－43 單克隆抗體，置濕盒4 ℃過夜；生物素標(biāo)記的二抗，室溫10 min；鏈酶親和素－過氧化物酶溶液，室溫10 min；然后滴加新鮮配制的DAB－H2O2顯色液，室溫顯色5～10 min；自來水沖洗，脫水、透明、中性樹膠封片；組織標(biāo)本置光鏡下觀察（放大倍數(shù)10×20）、照像，采用HPIAS－1000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定梗死灶周圍頂葉皮質(zhì)陽性表達(dá)物的吸光度值（OD 值）；每張切片隨機(jī)取5 個(gè)非重疊視野進(jìn)行測(cè)定然后取其均值。

1.7 腦梗死灶周圍組織蛋白的提取及Western blot檢測(cè)NgR 蛋白的表達(dá)水平

各組取6只大鼠在腦梗死后第7 d神經(jīng)功能評(píng)定結(jié)束后用過量的10%水合氯醛深度麻醉后快速斷頭取腦，在顯微鏡下用鋒利刀片切取左側(cè)梗死灶周圍頂葉腦組織，勻漿離心后取上清液Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取20μg樣本經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印蛋白至（polyvinylidene difluo－ride，PVDF）PVDF膜，脫脂奶粉封閉，加兔抗NgR單克隆抗體或抗β－actin 單克隆抗體（滴度為1∶1000），置4 ℃過夜，加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（滴度為1∶1000），置室溫1 h，曝光顯像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行掃描拍照，應(yīng)用BandScan V5.0版凝膠圖像軟件分析各目標(biāo)條帶灰度值（A值），以NgR／β－actin表示NgR 相對(duì)水平。

1.8 BDA 皮質(zhì)脊髓束順行示蹤

參照季達(dá)峰等報(bào)道的方法［5］。大鼠于腦梗死后第14 d用水合氯醛麻醉，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，以前囟為參照點(diǎn)，沿矢狀縫作一矢狀中線，分別在前囟中心前1.0mm、前囟中心、前囟中心后1.0mm、前囟中心后2.0mm 水平上，距中線左右各1.5 mm、2.5 mm 分別鉆直徑約0.5 mm 的孔，共8個(gè)孔；將微量注射器固定在立體定向注射儀上，以定位好的孔作為注射點(diǎn)，將10% BDA 溶液緩慢注射到每個(gè)孔中，每次劑量0.2μl，每個(gè)孔分別在距大腦皮層表面1.0mm 和2.0mm 處各注射一次；每注射一個(gè)層面等待2 min，再進(jìn)針，第二個(gè)層面注射完畢后，留針5 min，后緩慢退針；注射完畢后用骨蠟封住針眼，縫合頭皮；在大鼠BDA 注射注射2周后灌注取出腦及頸段脊髓，在中腦大腦腳及C1－3水平行連續(xù)冠狀位冰凍切片，片厚30μm；切片入1∶1000抗生物素蛋白－生物素－過氧化物酶復(fù)合溶液（用含0.3%Triton X－100 的0.01 mmol／L PBS 稀 釋）中孵育3 h，DAB 顯色，中性樹膠封片；每只大鼠在大腦腳水平及C1－3水平各取連續(xù)的3張切片在顯微鏡下觀察照像，采用HPIAS圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)5 個(gè)非重疊視野中BDA 染色陽性纖維的數(shù)目并取其平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)定

腦梗死后第1d，pNgR－shRNA1 組、pNgRshRNA2組、pCon 組及模型組mNSS 評(píng)分無明顯差異（P＞0.05）。腦梗死后第7、14 d，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組mNSS評(píng)分明顯低于pCon組及模型組（P＜0.05），而pCon組及模型組mNSS評(píng)分無明顯差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 神經(jīng)功能缺損評(píng)定 各組與pCon組及模型組比較，＃P＜0.05，△P＜0.05

2.2 各組大鼠梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)GAP－43表達(dá)變化

各組大鼠梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)均可見GAP－43陽性表達(dá)細(xì)胞，其表達(dá)位于細(xì)胞胞漿，呈細(xì)顆粒狀。雖與正常對(duì)照組相比，腦梗死各組表達(dá)水平均有明顯增高（P＜0.05），但是與pCon組及模型組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組 梗 死 灶 周 圍腦組織GAP－43的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，差異明顯（P＜0.05）（表1及圖3）。

表1 各組大鼠腦梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)GAP－43的表達(dá)（±s，OD 值）及NgR 相對(duì)表達(dá)量（±s，NgR／β－actin）

表1 各組大鼠腦梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)GAP－43的表達(dá)（±s，OD 值）及NgR 相對(duì)表達(dá)量（±s，NgR／β－actin）

注：與模型組及pCon 組比較，△P＜0.05，▲P＜0.05；與模型組比較，＃P＞0.05；與正常對(duì)照組比較，▽P＜0.05，＊P＜0.05

組別 n GAP－43表達(dá)水平NgR／β－actin表達(dá)水平正常對(duì)照組 6 0.13±0.011 0.14±0.036模型組 6 0.32±0.024＊ 0.41±0.058＊pCon組 6 0.29±0.022＃▽ 0.42±0.065＃▽pNgR－shRNA1組 6 0.45±0.031△ 0.26±0.043△pNgR－shRNA2組 6 0.43±0.040▲ 0.24±0.039▲

2.3 各組大鼠梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)NgR 表達(dá)水平

模型組及pCon組梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)均可見一定水平的NgR 表達(dá)，較正常對(duì)照組增高（P＜0.05）。與模型組及pCon 組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組NgR表達(dá)明顯降低（P＜0.05）（表1及圖5）。

2.4 BDA 皮質(zhì)脊髓束順行示蹤

各組大鼠在病變側(cè)大腦腳水平及病變對(duì)側(cè)C1－3水平脊髓均可見BDA 染色陽性纖維，與正常對(duì)照組相比，其他各組陽性纖維的數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。與模型組及pCon 組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2組大腦腳水平及C1－3水平BDA染色陽性纖維的數(shù)目明顯增多（P＜0.05）。同時(shí)觀察 發(fā) 現(xiàn)pNgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2 組經(jīng)健側(cè)發(fā)出跨過中線的側(cè)枝神經(jīng)纖維也較模型組及pCon組明顯增加（圖2及圖4）。

圖2 各組大鼠BDA 皮質(zhì)脊髓束順行示蹤 各組與pCon組及模型組比較，P＜0.05

3 討 論

在針對(duì)CNS損傷后髓磷脂相關(guān)抑制物的研究中目前主要通過應(yīng)用Nogo－A 抗體NI－l、髓磷脂或cDNA 疫苗、抗NgR 競(jìng)爭(zhēng)性肽段等。國外相繼有多位學(xué)者通過立體定向腦內(nèi)注射或鞘內(nèi)注射的方式將NI－l應(yīng)用到腦缺血大鼠的體內(nèi)，結(jié)果表明接受治療的大鼠神經(jīng)功能有明顯恢復(fù)，皮質(zhì)脊髓束傳導(dǎo)纖維有明顯的再生及發(fā)生可塑性調(diào)節(jié)［6，7］。另有研究顯示，應(yīng)用一種NgR 受體拮抗劑NEP1－40 能夠阻止其與Nogo－A 結(jié)合，NgR 不能被激活，于是發(fā)現(xiàn)軸突損傷減輕，再生增強(qiáng)［8］。這些中和性抗體或競(jìng)爭(zhēng)性肽雖然不同程度上對(duì)抗了髓磷脂相關(guān)抑制因子的作用，促進(jìn)軸索再生，但NI－1只能阻斷Nogo的軸突生長抑制作用，髓磷脂或cDNA 疫苗難以通過血腦屏障到達(dá)損傷局部，而且應(yīng)用Nogo－A 抗體或髓磷脂疫苗治療不能阻斷Nogo、MAG、OMgp等所有抑制分子的作用。盡管分子途徑的NgR 抗體或抗NgR 競(jìng)爭(zhēng)性肽段封閉Nogo蛋白與NgR 的結(jié)合，可能同時(shí)減輕這三個(gè)髓磷脂相關(guān)抑制因子的作用，但因其易受環(huán)境因素的影響，且肽段到達(dá)損傷部位的效率不高、作用時(shí)間短暫而限制了其在包括腦缺血在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病中的實(shí)際應(yīng)用。RNAi是由雙鏈RNA 介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后mRNA 水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)的過程。在此過程中，基因可以進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA，從而使基因在轉(zhuǎn)錄后mRNA 水平失活。通過RNAi技術(shù)直接沉默相關(guān)基因的表達(dá)來克服神經(jīng)再生抑制因子的作用無疑是一種合理的選擇。Zubair Ahmed等的研究證實(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元采用RNAi技術(shù)能有效沉默NgR、p75NTR及Rho－A mRNA，和對(duì)照組相比，其蛋白的表達(dá)分別下降100%、70%、和100%，上述基因沉默后背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突再生明顯增強(qiáng)［9］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RNAi質(zhì)粒組腦梗死大鼠NgR 表達(dá)明顯降低，提示抑制NgR 表達(dá)的RNA 干擾作用是成功和有效的。有研究結(jié)果表明，局灶性腦梗死后6 h，Nogo－A及NgR 的表達(dá)即開始升高，24 h達(dá)到高峰，持續(xù)7 d左右逐漸恢復(fù)到基礎(chǔ)水平［10］。本研究選擇在大鼠腦梗死蘇醒后即注射RNA 干擾質(zhì)粒，考慮在此時(shí)間段進(jìn)行干預(yù)，其效果最佳。

圖3 各組大鼠腦梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)GAP－43表達(dá)水平（SABC×200倍）

圖4 各組病變側(cè)大腦腳水平及病變對(duì)側(cè)C1－3水平脊髓BDA 染色陽性纖維數(shù)（×400倍）

圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠梗死周邊區(qū)大腦皮質(zhì)NgR 表達(dá)水平 A 為正常對(duì)照組；B為模型組；C 為pCon組；D 為pNgR－shRNA1 組；E 為pNgR－shRNA2組

腦梗死后神經(jīng)重塑是其功能恢復(fù)的重要機(jī)制，而神經(jīng)再生是其重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一。神經(jīng)再生主要是軸突再生，即受損的軸突重新芽生，或周圍未受損的軸突發(fā)芽，實(shí)現(xiàn)重新支配；或者樹突分支增加、延長，可以提供更多接觸面重建軸－樹連接［11］。生長 相 關(guān) 蛋 白43（growth－associated protein 43，GAP－43）是位于神經(jīng)元軸突生長錐中的組織特異性磷酸蛋白，主要作用是啟動(dòng)生長錐的形成，引導(dǎo)、促進(jìn)軸突生長。軸突出芽時(shí)GAP－43的表達(dá)增高，腦梗死后其表達(dá)時(shí)程發(fā)生變化，在24 h開始升高，7 d達(dá)高 峰［12］。本 實(shí) 驗(yàn) 中 發(fā) 現(xiàn)NgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2組梗死灶周圍腦組織GAP－43 表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示RNA 干擾下調(diào)NgR 的表達(dá)后因缺血受損的神經(jīng)元軸突再生明顯增加，神經(jīng)重塑增強(qiáng)。

腦梗死后皮質(zhì)脊髓束的可塑性變化既包括病側(cè)神經(jīng)纖維再生，也包括健側(cè)發(fā)出側(cè)枝進(jìn)行代償。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RNA 干擾抑制NgR 表達(dá)的兩組大鼠病變側(cè)BDA 陽性神經(jīng)纖維數(shù)目明顯增多，且發(fā)現(xiàn)經(jīng)健側(cè)發(fā)出跨過中線的側(cè)枝神經(jīng)纖維也明顯增加，這種皮質(zhì)脊髓束可塑性變化的增強(qiáng)是RNA 干擾抑制NgR 表達(dá)后促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的重要基礎(chǔ)。

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