慢病毒介導(dǎo)bFGF基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞對腦梗死后血管新生的影響

解燕春 關(guān)景霞 曾艷平 周 琴 梁靜靜

缺血性腦卒中后能啟動自身代償性血管新生（angiogenesis）以滿足代謝的需要［1］。血管新生的程度與范圍直接關(guān)系到梗死灶周圍血流灌注的改善，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，從而決定了患者的預(yù)后。然而，代償性血管新生不能完全代償腦組織的低灌注狀態(tài)，從而促進(jìn)神經(jīng)功能完全恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒載體介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），并將其定向移植到大鼠腦梗死灶周圍，探討其對腦梗死后血管新生和神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）儀器與試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記右旋糖 酐（fluorescein isothiocyanate－dextran，F(xiàn)ITCdextran）購自美國Sigma公司，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Compa，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；（2）實(shí)驗(yàn)動物：雄性清潔級SD 大鼠，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；（3）病毒株：攜帶入bFGF 和 綠 色 熒 光 蛋 白（green fluorescent protein，GPF）基因的慢病毒載體（lenti－bFGFf－GFP）購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)

健康雄性SD 大鼠過量麻醉處死后，無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨，剪去兩側(cè)干骺端，沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液，離心棄上清液，沉淀用含20%FBS的DMEM 培養(yǎng)液重新懸浮，充分吹打混勻，計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。待培養(yǎng)箱中細(xì)胞生長至80% ～90%時(shí)，在超凈工作臺內(nèi)以2.5 g／L胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，2～3 min后按1 傳3的比例傳代接種于新培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 攜帶bFGF和GFP基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs

取第3 代BMSCs進(jìn)行胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104接種于24孔板中加入20%FBS的DMEM，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)至40% 融合。在轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）為50 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。按MOI為50，加入攜帶人bFGF和GFP基因的慢病毒，同時(shí)加入聚凝胺（polybrene）至終濃度為8μg／ml，感染后第2 d，換上含Blasticidin（5 mg／L）的完全培養(yǎng)液，此后每隔3 d更換含Blasticidin的完全培養(yǎng)液1次，共篩選14 d，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染bFGF 基因的BMSC s供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 動物模型制備與分組

采用改良的線栓法制作大鼠永久性大腦中動脈閉塞模型。模型成功的標(biāo)志為動物蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征，對側(cè)以前肢為重的偏癱，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。模型成功后實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為對照組，BMSCs組及bFGF－BMSCs組。

1.2.4 BMSCs細(xì)胞移植

造模成功的SD 大鼠術(shù)后1 d使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，俯臥固定于立體定位儀上，使用微量注射器將10μl細(xì)胞懸液（含1×106個(gè)細(xì)胞）緩慢注入到梗死側(cè)紋狀體區(qū)：前囟后2 mm，中線旁2 mm，進(jìn)針深度為4 mm。

1.2.5 神經(jīng)功能評分

所有模型大鼠在MCAO 術(shù)前0d、術(shù)后1、3、7及14 d，采用雙盲法進(jìn)行改良神經(jīng)損害評分（modified neurologica severity score，mNSS）。該評分對運(yùn)動、感覺、平衡及反射4個(gè)方面進(jìn)行綜合評價(jià)，總分18分。評分越高，神經(jīng)損傷程度越重。

1.2.6 梗死灶周圍三維微血管直徑、分支數(shù)目及面積測定

造模成功14 d后，用10%水合氯醛按0.35 ml／kg體重腹腔麻醉后，經(jīng)股靜脈注射FITC－dextran 1 ml（50 mg／ml），注射完畢1 min后迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛4℃后固定48 h后做冠狀振蕩切片，片厚為100μm，選取缺血側(cè)梗死灶周圍區(qū)8個(gè)興趣區(qū)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，氬離子激光器在488 nm 處激發(fā)522 nm 的發(fā)射光，分辨率為512×512像素，XYZ掃描模式，線平均和面平均均為2，物鏡鏡頭20X，以0.5μm 步長進(jìn)行序列掃描100層，運(yùn)用Leica TCS SP2 2.61軟件進(jìn)行3D 重建，獲得圖像體積為750μm×750μm×50μm。采用3D Doctor 3.5分析血管直徑和面積，血管分支數(shù)目在三維立體圖像上手工計(jì)算。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)特征

原代細(xì)胞剛接種時(shí)呈圓形，接種24 h后可見部分大圓形單核細(xì)胞貼壁，骨髓中的造血干細(xì)胞不會貼壁，在每次換液中逐漸清除掉。3 d后大部分細(xì)胞都貼壁，呈梭形并帶有2－3個(gè)長的突起，細(xì)胞核較大。當(dāng)相鄰集落融合成片達(dá)80%以上，細(xì)胞排列呈漩渦狀。傳代后，細(xì)胞呈長梭形均勻分布貼壁生長，隨著傳代次數(shù)的增加，BMSCs純度越來越高，傳至第三代BMSCs的純度達(dá)95%以上（圖1）。

圖1 第3代BMSCs（×400倍）

2.2 bFGF重組慢病毒感染BMSCs感染效率

以不同感染復(fù)數(shù)（Multiply of Infection，MOI）的慢病毒感染第3 代BMSCs。12h 后即可在熒光顯微鏡下觀察到GFP 的表達(dá)，但陽性率較低。GFP的表達(dá)在48h達(dá)到最高。轉(zhuǎn)染效率隨MOI增加而增加，但超過一定MOI值時(shí)轉(zhuǎn)染陽性率反而出現(xiàn)下降，在MOI＝50時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)90%以上（圖2），可滿足試驗(yàn)需求。

圖2 BMSCs不同病毒感染復(fù)數(shù)的感染率

2.3 神經(jīng)功能評分

術(shù)前0d、術(shù)后1 d，對照組、BMSCs組及bFGFBMSCs組mNSS評分無顯著性差異。術(shù)后3d各組大鼠神經(jīng)功能有不同程度的恢復(fù)，對照組與BMSCs組無顯著性差異，而bFGF－BMSCs組神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組與BMSCs組（P＜0.05）。術(shù)后7及14 dBMSCs組和bFGF－BMSCs組mNSS評分顯著低于對照組（P＜0.05），而且bFGF－BMSCs組神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于BMSCs組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評分 與對照組比較，＊P＜0.05；與BMSCs組比較，△P＜0.05

2.4 血管新生情況

鏡下可見對照組梗死灶周圍微血管不規(guī)則扭曲，且由于血腦屏障被破壞可見FITC－dextran滲透到血管周圍組織（圖4A）。BMSCs組（圖4B）及bFGFBMSCs組（圖4C）微血管直徑、分支數(shù)目及面積顯著性高于對照組。與BMSCs組相比，bFGF－BMSCs組微血管直徑、分支數(shù)目及面積顯著增加。各組微血管直徑、面積和分支數(shù)目定量分析比較見表1。

表1 微血管形態(tài)定量測定（±s）

表1 微血管形態(tài)定量測定（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＃P＜0.01；與BMSCs組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01

組別 血管直徑（μm）血管分支數(shù)目（根）血管面積（×105μm2）11 BMSCs組 4.14±0.09＊ 59±4.5＃ 7.28±0.46＃bFGF－BMSCs組 4.75±0.09＃△ 72±5.2＃☆ 9.54±0.66＃△對照組 3.67±0.11 42±3.6 6.32±0.

圖4 bFGF基因修飾BMSCs對腦梗死后血管新生的影響 A 為對照組；B為BMSCs組；C為bFGF－BMSCs組

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)腦組織缺血缺氧后能啟動自身代償性血管新生以滿足代謝的需要，且血管密度越大者預(yù)后越好，存活時(shí)間越長［2，3］。然而，在高血壓病、糖尿病及高脂血癥等病變條件下血管新生的能力下降。因此，有人提出治療性血管新生，其治療策略包括引入外源性生長因子和細(xì)胞替代治療。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)釋放bFGF能促進(jìn)心肌梗死后的血管新生及心功能恢復(fù)［4］。2007 年一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)采用可生物降解的明膠持續(xù)釋放bFGF治療嚴(yán)重肢體缺血患者，其結(jié)果顯示bFGF能促進(jìn)血管新生，改善患者的步行距離［5］。

BMSCs取材方便，容易擴(kuò)增，免疫原性低，是細(xì)胞替代治療的理想靶細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)成體BMSCs能“歸巢”到損傷部位，參與血管新生，增加缺血區(qū)的血流灌注，促進(jìn)腦損傷后的功能恢復(fù)［6，7］。Chen等研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可分泌bFGF和血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等血管生長因子促進(jìn)血管新生［8］。Bao等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)定向移植BMSCs能促進(jìn)血管新生和內(nèi)源性神經(jīng)再生，從而改善缺血性卒中大鼠的神經(jīng)功能［9］。Cobellis等采用自體移植BMSCs治療嚴(yán)重肢體缺血患者，隨訪12月后患者的踝臂指數(shù)及無痛行走距離明顯改善［10］。

然而，盡管動物實(shí)驗(yàn)和臨床前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)治療性血管新生能改善血流灌注，促進(jìn)功能恢復(fù)，但幾項(xiàng)大型隨機(jī)雙盲安慰劑對照多中心研究卻以失敗告終。與實(shí)驗(yàn)動物年輕、沒有基礎(chǔ)疾病等因素有關(guān)外，還可能與單一治療無法建立有效、穩(wěn)定的新生血管有關(guān)［11］。

慢病毒載體具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)及直接腦內(nèi)注射表達(dá)時(shí)間長［12］等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒載體介導(dǎo)入bFGF基因修飾BMSCs聯(lián)合治療。本研究結(jié)果顯示MCAO 術(shù)后定向移植bFGF－BMSCs后能顯著改善 大 鼠 神 經(jīng) 功 能。bFGF－BMSCs 移 植 后3、7 及

14 d神經(jīng)功能恢復(fù)較對照組和BMSCs移植組有明顯改善。與對照組和BMSCs移植組相比，bFGFBMSCs移植后14d梗死灶周圍微血管直徑、分支數(shù)目及面積顯著增加。本研究認(rèn)為bFGF－BMSCs移植后可通過替代治療及持續(xù)分泌生長因子改善局部內(nèi)環(huán)境更好地促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。我們推測神經(jīng)功能恢復(fù)還可能與血管新生后有效促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生有關(guān)。

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