丹參多酚酸鹽對缺血再灌注損傷大鼠腦組織BDNF和GDNF的影響

王 強 張 一 王 榕 楊伊林 李 璐 屈洪濤 夏錫偉 支 楓

腦源性神經生長因子（BDNF）和膠質源性神經營養因子（GDNF）是神經生長因子家族的成員，研究發現組織缺血缺氧后腦內BDNF 和GDNF 釋放量明顯增多，且對缺血缺氧性損傷具有保護作用。丹參多酚酸鹽注射液是國家二類中藥新藥，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循環、抗氧化損傷的作用［1］。本研究采用栓塞大鼠大腦中動脈并再灌注模型，觀察丹參多酚酸鹽對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中BDNF和GDNF表達的影響，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 SD 大鼠購自蘇州大學實驗動物中心。注射用丹參多酚酸鹽（中國上海綠谷藥業，批號20070101），BDNF及GDNF ELISA 試劑盒購自美國R＆D 公司，氯化三苯基四氮唑（TTC）購自北京化學試劑公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 動物分組及模型制作 成年雄性SD 大鼠48只，體重230～250 g，隨機分為正常對照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量組（10 mg／kg）及丹參多酚酸鹽高劑量組（30 mg／kg），每組各12只；參照Longa［2］法，制作大鼠MCAO模型。大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg／kg），頸部正中切口，分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）；結扎CCA 近心端、ECA 起始端后，翼腭動脈短暫夾閉以防誤插，經CCA插入線栓（線栓為直徑0.23 mm進口魚線，頭端涂抹石蠟［3］），插入深度由分叉部記（18.0±0.5）mm；再灌注處理為拉線栓使線頭退至頸外動脈；術中維持肛溫（37±0.5）℃；缺血時間2 h，再灌注72 h；在缺血期間及再灌注后2 h保持體溫在（37±0.5）℃；丹參低劑量及高劑量治療組在術后60 min、術后第1 d及第2 d分別將10 mg／kg及30 mg／kg的丹參多酚酸鹽溶于生理鹽水中，腹腔注射；正常對照組和缺血再灌注組腹腔注射等量的生理鹽水。模型成功的標志為大鼠手術麻醉清醒后出現左側肢體癱瘓，站立不穩，提尾時向一側轉圈。

1.3 神經功能缺損評分 各組大鼠于蘇醒后6 h內按照Zea Longa和Bederson的方法進行評分，0分：無神經缺損癥狀；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右側旋轉；3分：向右側傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。評分為0分、有呼吸困難、提前死亡及處死后發現有蛛網膜下腔出血者均棄去不用，手術中出血過多的大鼠亦予以剔除，并均在后續實驗中補足。建模成功大鼠缺血再灌注后24 h再次評分，將此分數錄入。

1.4 腦梗死體積的測定 每組隨機選擇6只大鼠，適時斷頭取腦，棄去嗅球、小腦及低位腦干；置－20℃冰箱中冷凍20 min，距額極3mm 開始切片，每片厚2 mm，放入1%TTC 水溶液中，37℃孵育30 min；缺血區染成白色，有正常血供的腦組織為紅色；染色后以10%甲醛溶液避光保存24 h，數碼相機拍照后應用病理圖象分析儀測定梗死面積，根據公式V＝（A1＋…＋An）t／2算出梗死體積，其中t為切片厚度，A 為梗死面積。

1.5 BDNF 及GDNF 含量測定 除正常對照組外，各組大鼠再灌注72 h后使用2%戊巴比妥鈉過量麻醉，快速斷頭取腦，在冰盤上分離雙側皮層，冰生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后，放于凍存管中，置于液氮中保存待用。每組取缺血側皮層組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，準確稱重后，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的勻漿，2 500轉／min，離心10 min，小心收集上清保存于－70℃冰箱待測。ELISA 法檢測BDNF 及GDNF 的含量，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理 數據用mean±SD 表示，采用SPSS12.0統計軟件包，以單因素方差分析和t檢驗作差異的顯著性分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 行為學評分 缺血再灌注組，丹參多酚酸鹽低劑量組和高劑量組行為學評分分別為（3.08±0.67）、（2.42±0.79）和（1.75±0.62）分。與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯降低實驗大鼠的行為學評分，且高劑量組降低較低劑量組更為顯著（P＜0.05）（表1）。

2.2 腦梗死體積 缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量組和高劑量組其腦梗死體積分別為（238.92±14.36）、（187.53±12.18）和（155.33±11.24）mm3。與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯減少實驗大鼠的腦梗死體積，且高劑量組較低劑量組更為顯著（P＜0.05）（表1）。

表1 不同組別大鼠行為學評分及腦梗死體積測定（±s）

表1 不同組別大鼠行為學評分及腦梗死體積測定（±s）

注：缺血再灌注組比較，＊P＜0.01；與丹參低劑量組，▼P＜0.05

組別 神經功能缺損評分（分，n＝12）腦梗死體積（mm3，n＝6）缺血再灌注組 3.08±0.67 238.92±14.36丹參低劑量組 2.42±0.79＊ 187.53±12.18﹡丹參高劑量組 1.75±0.62﹡▼ 155.33±11.24﹡▼

2.3 BDNF及GDNF 含量 正常對照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽（10 mg／kg）組和丹參多酚酸鹽（30 mg／kg）組BDNF 含 量 分 別 為（7112.0±933.3）、（11376.5±1366.4）、（18056.9±1399.2）和（21901.1±1560）pg／g。GDNF 含 量 分 別 為（1304.6±153.7）、（2877.8±3 55.1）、（5386.3±739.1）和（6884.1±469.7）pg／g（表2）。與正常對照組比較，缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽（10 mg／kg）組和丹參多酚酸鹽（30 mg／kg）組BDNF及GDNF含量明顯增加（P＜0.01）。與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽（10 mg／kg）組和丹參多酚酸鹽（30 mg／kg）組BDNF及GDNF含量明顯升高（P＜0.01），且丹參多酚酸鹽（30 mg／kg）組含量高于丹參多酚酸鹽（10 mg／kg）組（P＜0.01）（表2）。

表2 不同組別大鼠腦組織中BDNF及GDNF的含量（±s，n＝6，pg／g）

表2 不同組別大鼠腦組織中BDNF及GDNF的含量（±s，n＝6，pg／g）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與缺血再灌注組比較，▼P＜0.01

指標 正常對照組 缺血再灌注組 丹參多酚酸鹽組（10 mg／kg）丹參多酚酸鹽組（30 mg／kg）BDNF 7112.0±933.3 11376.5±1366.4＊ 18056.9±1399.2＊▼ 21901.1±1560.0＊▼GDNF 1304.6±153.7 2877.8±355.1＊ 5386.3±739.1＊▼ 6884.1±469.7＊▼

3 討 論

腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及膠質源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）均屬于神經營養因子（nerve growth factor，NGF）家族，對神經元的生存、分化和生長起著重要的作用。

腦缺血后BDNF 的變化最早由Lindvall等發現，隨后許多學者進行了更為深入的研究。在MCAO 后15 min后缺血區外圍的額葉和扣帶回皮層的BDNF mRNA 表達水平明顯升高，2 h后BDNF mRNA 在雙側扣帶回顆粒細胞和海馬CA1、CA3區錐體神經元中的表達水平明顯升高。但是在缺血核心區BDNF mRNA 沒有明顯變化，這可能與缺血引起的信號轉導或轉錄因子合成受到抑制有關［4］。BDNF蛋白表達水平在缺血后變化不盡相同，缺血1周后在CA3和扣帶回區其表達量仍較對照組增加了131%和124%。而在CA1區和皮層其表達量則減少了73%～75%［5］。GDNF 在缺血后有兩次表達高峰，分別由缺血引發的神經元退行性變及活化的膠質細胞所調節。腦組織不同區域BDNF及GDNF的變化與神經元抗缺血損傷的能力相關，使用外源性BDNF及GDNF同樣能發揮缺血腦保護作用［6］。動物實驗研究還發現BDNF 及GDNF可以縮小腦缺血后的梗塞面積，保護半暗區神經元，有利于受損神經元的修復［7，8］。這些研究結果證實了腦缺血后BDNF 及GDNF 表達水平的上調，是一種自身保護機制，能對抗缺血性腦損傷，減輕神經元的死亡。

BDNF與GDNF 缺血腦保護作用的具體機制目前尚不完全清楚，可能與下列因素有關：（1）抑制神經元凋亡，（2）對抗自由基損傷，（3）拮抗興奮性氨基酸（EAA）的毒性作用。BDNF 還能減輕鈣超載，并促進神經元軸突發芽和突觸的生長。但這兩種神經營養因子作為堿性蛋白質，難以通過血－腦屏障，無法通過全身給藥治療中樞神經系統疾病，而顱內直接給藥尚存在許多問題。基因治療雖前途無量，但目前仍然不能應用到臨床。

丹參多酚酸是丹參水溶性成分中重要的有機酸類化合物，動物實驗表明，丹參多酚酸對實驗性腦缺血具有顯著的改善作用。可縮小梗死面積，減輕腦組織水腫，改善腦缺血動物神經癥狀等，并且具有良好的安全性和可控性［9］。本研究發現，丹參多酚酸鹽能明顯提升腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中BDNF及GDNF的含量，且隨著藥物劑量的增加，其提升作用越發明顯。因此，本研究推測這可能是丹參多酚酸鹽發揮缺血腦保護的作用機制之一，可成為提高腦內內源性神經營養因子表達的途徑。

1 劉艾林，李銘源，王一濤，等.丹參藥理學活性物質基礎研究現狀.中國藥學雜志，2007，42（9）：641－646.

2 Longa EZ，WeinsteinPR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke ，1989，20（1）：84－91.

3 楊 濤，劉 勇，常燕群.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的改進及評價.中國臨床康復，2006，10（30）：171－173.

4 Kokaia Z，Zhao Q，Kokaia M，et la.Regulation of brain－derived neurotrophic factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion with and without brain damage.Exp Neurol，1995，136（1）：73－88.

5 Kokaia Z，Nawa H，Uchino H，et al.Regional brain－derived neurotrophic factor mRNA and protein levels following transient forebrain ischemia in the rat.Brain Res Mol Brain Res，1996，38（1）：139－144.

6 Sch?bitz WR，Schwab S，Spranger M，et al.Intraventricular brain－derived neurotrophic factor reduces infarct size after focal cerebral ischemia in rats.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17（5）：500－506.

7 張三明，魯 翔.BDNF 在局部腦缺血大鼠的表達.江蘇醫藥，2008，34（10）：1032－l033.

8 杜 杰，高小青，陳 波，等.GDNF基因修飾的神經干細胞移植治療大鼠局灶性腦缺血的實驗研究.重慶醫科大學學報，2010，35（3）：346－349.

9 蔣玉風，王秋華，劉智勤，等.丹酚酸B對缺血小鼠腦能量代謝和腦水腫的影響.中國病理生理雜志，2007，23（12）：2300－2303.