辣椒素對食管鱗狀細胞癌細胞凋亡和NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響*

田 芳,江亞南，張曉艷，范天黎

1)鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率居整個惡性腫瘤的第6位[1]。食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌)是一種侵襲性很強的腫瘤，預后差，臨床進展迅速，多伴有淋巴結轉移，且易復發。核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是近年來發現的轉錄調控因子，是由p50和p65組成的異源二聚體。在絕大多數靜止期的細胞中，NF-κB與其阻抑物IκBα蛋白相結合，以非活性形式存在于細胞質中。許多刺激物可以通過對IκBα的磷酸化而使其降解，使解離的NF-κB進入到核內并暴露核識別位點，從而促進靶基因的轉錄。研究[2-4]表明，在許多人類腫瘤(如肝癌、腸癌、食管鱗癌)中，NF-κB信號通路的激活在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分，具有抗病毒、 抗腫瘤和鎮痛消炎作用，還可作為健胃劑，有促進食欲、改善消化等生物學功能。最近有研究[5]表明，辣椒素可以抑制腫瘤細胞的增殖、促進凋亡，因此可以作為一種藥物或傳統化療藥物的輔助用藥，用于腫瘤治療。作者應用Western blot及凝膠滯留實驗檢測辣椒素對食管鱗癌EC9706和Eca109細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達和細胞凋亡的影響，探討辣椒素是否能夠通過阻斷NF-κB信號通路，對食管鱗癌細胞的凋亡產生影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和細胞主要試劑：抗人p65、磷酸化IκBα(pIκBα)、Bcl-2單克隆抗體和兔抗人p50、IκBα多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒、生物素3’末端標記試劑盒、化學發光EMSA試劑盒購自Pierce公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國Eckman coulterTM公司。RPMI 1640 培養液購自美國Gibco公司，辣椒素購自美國Sigma公司，氟尿嘧啶(5-FU)購自上海旭東海普藥業公司。EC9706細胞由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈，Eca109細胞由鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室保存，細胞在RPMI 1640培養液(含體積分數10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)中，于37 ℃、體積分數為5% CO2的條件下培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2辣椒素的配制將辣椒素溶解在乙醇中，配成300 μmol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱保存。臨用時，以完全培養液稀釋辣椒素到所需濃度。對照組培養液為含體積分數10%小牛血清的RPMI 1640培養液。

1.3Westernblot法檢測p65、p50、IκBα、pIκBα和Bcl-2蛋白的表達分別提取2種細胞的胞質和胞核蛋白各50 μg，Western blot法檢測p65、p50、IκBα和pIκBα蛋白的表達。將2種細胞分別用0、50、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集細胞，測定pIκBα蛋白的表達；同時提取總蛋白來檢測Bcl-2蛋白的表達。使用120 g/L的SDS-PAGE膠，將分離蛋白轉移到硝酸纖維膜上，于50 g/L脫脂奶粉溶液中作用2 h后，加入一抗(按照1100稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌3次，10 min/次，將膜放到標記有辣根過氧化物酶的二抗(按照150 000稀釋)中，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，DAB顯色。

1.4NF-κB與DNA結合活性的檢測采用凝膠滯留實驗。將細胞分別用0、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集細胞，提取細胞核蛋白。生物素標記的NF-κB探針序列：上游5’-AGTTGAGGG GACTTTCCCAGGC-3’,下游3’-TCAACTCCCCTGAA AGGGTCCG-5’。將探針與10 μg細胞核提取物在20 μL的緩沖液中充分結合，在60 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，將其轉移到帶正電荷的尼龍膜上，紫外燈下交聯5 min，使用化學發光的方法，通過X線曝光，進行顯影和定影。

1.5細胞凋亡的檢測將2種食管鱗癌細胞分別分為對照組、辣椒素組(加入辣椒素作用48 h)、5-FU組(加入5-FU作用48 h)和聯合組(同時加入辣椒素和5-FU作用48 h)，每組設3個復孔。收集4組細胞，制備單細胞懸液，計數2×106個細胞，轉移進離心管離心，棄上清，使用預冷的PBS洗2次。加2.5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC到100 μL的細胞懸液中，混勻后，使用對照細胞調零，分別以PI和Annexin V-FITC單染管作為基準參照，流式細胞儀檢測，使用CellQuest 3.0軟件對數據進行分析，計算凋亡細胞百分比。

1.6統計學處理采用SPSS 13.0進行分析， 采用2×2析因設計的方差分析比較4組凋亡細胞百分比的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1EC9706和Eca109細胞中NF-κB信號通路的激活情況

2.1.1 蛋白檢測結果 EC9706和Eca109的細胞質中IκBα蛋白為強表達，而pIκBα蛋白的表達稍弱(圖1)。2種細胞的胞核中均存在p50和p65蛋白(圖2)。

2.1.2 凝膠滯留實驗結果 在2種食管鱗癌細胞的胞核中，NF-κB與 DNA的結合活性較高(圖3)。

圖1 2種細胞胞質中IκBα和pIκBα蛋白的表達

圖2 2種細胞胞核中p50和p65蛋白的表達

圖3 NF-κB與DNA的結合活性

2.2辣椒素對2種食管鱗癌細胞pIκBα和Bcl-2蛋白表達的影響2種細胞中pIκBα和Bcl-2蛋白的表達均隨著辣椒素作用濃度的增加逐漸下降(圖4)；NF-κB與DNA的結合活性隨著辣椒素作用濃度的增加逐漸下降(圖5)。

圖4 辣椒素對EC9706(上)和Eca109(下)細胞pIκBα和Bcl-2蛋白表達的影響

圖5 辣椒素對EC9706(左)和Eca109(右)細胞NF-κB與DNA結合活性的影響

2.3辣椒素對食管鱗癌細胞凋亡的影響見表1、2。

表1 辣椒素對EC9706細胞凋亡的影響(n=3)

F辣椒素=2 535.497，F5-FU=4 141.322，F交互=113.034，P均<0.001。

表2 辣椒素對Eca109細胞凋亡的影響(n=3)

F辣椒素=5 984.040，F5-FU=8 316.346，F交互=5.150，P均<0.05。

3 討論

研究[5]認為食物中的化學成分可以特異性影響信號通路中的特定分子，從而預防癌癥的發生。腫瘤化學預防是指利用天然的或合成的化學物質來阻止、減緩或者逆轉癌癥發生發展過程或者復發的策略。研究[6-7]發現辣椒素可以通過不同的機制發揮抗炎抗腫瘤作用。

該實驗結果表明，在食管鱗癌細胞核中存在有NF-κB異源二聚體p50和p65的表達，且進入到核內的亞單位p50和p65能夠與DNA結合并促進轉錄。NF-κB的半衰期較短，因此維持其活性就需要持續的外界刺激及蛋白合成。該實驗結果還發現，IκBα及pIκBα蛋白在食管鱗癌細胞中有表達，pIκBα的表達盡管比較弱，但足以引起IκBα的降解，刺激NF-κB的活化。上述結果顯示，在維持活化的NF-κB信號通路中IκBα在轉錄水平上的高表達及其磷酸化，起著重要的作用。

該實驗結果顯示，隨著辣椒素濃度的增加，食管鱗癌細胞中pIκBα蛋白的表達逐漸下降，NF-κB與DNA的結合活性也逐漸下降。pIκBα表達水平的降低，會使NF-κB與IκBα蛋白相結合，以非活性形式存在于細胞質中，從而抑制NF-κB信號通路的活化；辣椒素通過抑制食管鱗癌細胞中IκBα的磷酸化，使p50和p65組成的異源二聚體不能從NF-κB-IκBα上解離，從而抑制了NF-κB與DNA的結合活性。

Maity等[8]的研究表明，辣椒素可以通過抑制蛋白酶的功能，激活凋亡信號通路，從而誘導細胞凋亡。該研究表明，在辣椒素作用下，食管鱗癌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下降；流式細胞儀檢測的結果顯示，食管鱗癌細胞凋亡增加；當辣椒素與5-FU合用時，可顯著增加食管鱗癌細胞對化療藥物5-FU的敏感性，凋亡的細胞也增加。該研究結果提示，辣椒素促進食管鱗癌細胞對5-FU敏感性的機制，或許是通過阻斷NF-κB信號通路的活性，下調其調控的下游靶基因，從而對食管鱗癌細胞的增殖、抗凋亡產生影響。

綜上所述，辣椒素可能通過下調NF-κB信號通路的活性，促進食管鱗癌細胞凋亡，增加對5-FU的敏感性。辣椒素有望成為食管鱗癌化學預防中的輔助用藥。

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