EC9706細胞和人食管鱗狀細胞癌組織中MAL基因啟動子區的甲基化狀態

劉伯新，郭長青#，王曼華，王明榮

1)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052 2)中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室 北京 100021

MAL基因是由Alonso等[1]于1987年分離得到的一個在T細胞分化中晚期表達的基因。研究[2-4]表明MAL基因在多種腫瘤中表達下調或者缺失，DNA甲基化被認為是該基因失活的可能機制之一[5-8]。該研究利用亞硫酸氫鹽測序法檢測人食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌)細胞系EC9706中MAL基因啟動子區CpG位點的甲基化情況，并采用甲基化敏感性限制性內切酶酶切結合PCR技術進一步檢測食管鱗癌組織MAL基因啟動子區的甲基化情況，以期對食管鱗癌發生發展的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1材料26例食管鱗癌及其配對癌旁正常食管組織取自鄭州大學第一附屬醫院2009年1月至2011年12月住院手術患者，男22例，女4例，年齡46～74(57.2±8.3)歲。其中腫瘤直徑≥3 cm 24例，<3 cm 2例；高、中分化19例，低分化7例；侵襲深度未達肌層2例，肌或肌外層24例；有淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移3例；有遠處轉移20例、無遠處轉移6例。患者術前均未接受放化療，所有標本經組織病理學檢查證實為食管鱗癌。標本取材后置液氮中速凍，然后置-70 ℃冰箱保存。EC9706細胞由鄭州大學基礎醫學院微生物和免疫學教研室提供，常規培養，至70%～80%飽和密度時收獲細胞。

1.2EC9706細胞MAL基因啟動子區甲基化檢測

1.2.1 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化回收

提取EC9706細胞的基因組DNA，采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提。DNA樣品中加入3 mol/L NaOH 42 ℃水浴30 min，加入新配制的10 mmol/L氫醌30 μL和3.6 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL，加200 μL石蠟油，50 ℃避光水浴16 h。用Wizard DNA Clean-up System(Promega公司產品)純化DNA。加3 mol/L NaOH 5.5 μL，37 ℃孵育15 min，加1 μg鮭精DNA，加10 mol/L乙酸銨33 μL，再加270 μL冰無水乙醇，-20 ℃過夜沉淀，12 000 r/min離心10 min，加體積分數70%乙醇離心，空氣中干燥后加20 μL TE溶液，-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增 MAL基因啟動子區引物序列：上游5’-GTGGTTGGTTTTATTTTTTATTGTAGATTT-3’，下游5’-CAAAAACCACTCACAAACTCAAAAAT-3’，產物大小699 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，其中包含DNA 0.5 μL，Master Amp 2×PCR Premix buffer 12.5 μL，引物0.4 μmol/L各1 μL，Taq酶2 U(日本TaKaRa公司)。反應條件：94 ℃預變性5 min后，94 ℃ 40 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 130 s，進行35個循環，最后于72 ℃延伸7 min。PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QIAEXⅡ Agarose gel extraction試劑盒回收，將終產物送至大連日本TaKaRa公司進行測序。

1.3食管組織MAL基因啟動子區甲基化檢測

1.3.1 DNA甲基化敏感性限制性內切酶EheⅠ酶切及純化 組織標本采用酚-氯仿抽提法提取DNA，50 μL酶切體系內含10×buffer 5 μL，EheⅠ 10 U，基因組DNA 1 μg，上加礦物油200 μL，37 ℃酶切過夜。吸棄礦物油，酚-氯仿抽提純化DNA。

1.3.2 PCR擴增 MAL基因5’調控區(含啟動子區)引物序列：上游5’-TCAGTGGACGCGGAAGG-3’，下游5’-GAGCCACTCACAAACTCAAAGATC-3’，產物大小為724 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系及循環參數同1.2.2。取10 μL上樣于1.5 g/L瓊脂糖凝膠(含0.1 g/L溴化乙錠)電泳。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用配對χ2檢驗分析食管鱗癌及配對癌旁正常食管組織中MAL基因啟動子區甲基化率的差異，應用Fisher確切概率法分析不同臨床病理因素食管鱗癌組織中MAL基因啟動子區甲基化率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1EC9706細胞MAL基因啟動子區的甲基化情況EC9706細胞基因組DNA經亞硫酸氫鹽修飾后PCR擴增結果見圖1。MAL基因啟動子區699 bp范圍內檢測出42個胞嘧啶位點的甲基化，占所有CpG位點的73.7%(42/57)。

圖1 EC9706細胞MAL基因啟動子區的PCR結果

2.2食管組織中MAL基因啟動子區的甲基化情況PCR擴增結果見圖2、表1。

圖2 2種食管組織MAL基因啟動子區PCR結果

表1 2種食管組織中MAL基因啟動子區的甲基化情況 例

配對χ2=10.924,P<0.001。

2.3不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動子區的甲基化情況見表2。

表2 不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動子區的甲基化情況

3 討論

MAL基因表達一個高度疏水性蛋白，即 MAL蛋白，這個蛋白缺少一個疏水的引導肽序列，并包含四個被短親水片段分離開的潛在跨膜區域[1]。MAL基因可能是高爾基體和遠端質膜之間囊泡轉運和蛋白質分選的一個功能成分[9-11]。

許多腫瘤組織中MAL基因表達異常，基因甲基化可能是MAL基因失活的主要機制[12]。許智雄等[13]發現MAL基因在92.7%(38/41)食管癌組織中表達顯著下調，且在3個食管癌細胞株未見表達，認為MAL基因表達下調是食管癌發生、發展過程中的一個頻發事件。Mimori等[14]發現MAL基因在食管上皮細胞的分化和角質化中起調節作用。Zinovyeva等[15]通過cDNA序列分析和RT-PCR對人食管癌和正常食管黏膜組織進行分析，也發現MAL基因在腫瘤組織中表達下調。郭長青等[8]對食管癌MAL基因表達下調機制進行了探討，對MAL基因的5’調控區進行克隆和序列分析，結果表明食管癌中可能存在MAL基因5’調控區的點突變。根據以上研究推測MAL基因啟動子區可能存在甲基化，這可能是食管癌MAL基因表達下調的機制之一。

該研究發現在EC9706細胞中MAL基因啟動子區有42個CpG位點的胞嘧啶發生了甲基化，占所有CpG位點的73.7%(42/57)，提示MAL基因啟動子區的甲基化可能導致MAL基因轉錄沉默。該研究亦發現食管鱗癌組織中MAL基因啟動子區的甲基化率高于癌旁正常食管組織，不同臨床病理特征患者食管鱗癌組織中MAL基因啟動子區甲基化率差異均無統計學意義。

綜上所述，在食管黏膜的癌變過程中MAL基因啟動子區CpG島可能發生了甲基化，導致MAL基因的轉錄沉默，表達水平顯著下調，從而導致食管黏膜癌變的發生。

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