血清對SH-SY5Y細胞嗎啡戒斷后ERK1/2、p38和JNK磷酸化表達的影響*

李文杰，王明洋，白銀亮，程月芳，李 靜，劉 宇，張 旗#

1)鄭州大學藥學院臨床藥學系 鄭州 450001 2)蘭州大學第二醫院藥劑科 蘭州 730030 3)河南省腫瘤醫院藥劑科 鄭州 450008

細胞外信號調節激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一員，有研究[1]表明ERK(尤其是ERK1/2)信號轉導通路參與嗎啡依賴戒斷過程。多種細胞模型被用于研究嗎啡依賴和戒斷過程中ERK1/2磷酸化的表達情況，但研究結果并不一致，甚至相反；作者還發現不同研究者建立細胞嗎啡依賴與戒斷模型中所用的血清濃度和納洛酮濃度等實驗條件并不相同[2-5]。而血清作為體外細胞培養必需的一種天然培養基，成分復雜，其中含有的大量促生長的成分如生長因子、激素、貼壁因子等對MAPKs家族激酶活性的影響較大[6-7]，所以作者推測血清對研究嗎啡依賴與戒斷過程中ERK的磷酸化水平會有明顯影響。神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)來源于神經母細胞瘤細胞(SK-N-SH)株[8]，表達μ、δ阿片受體[9]，已廣泛用于建立細胞嗎啡依賴和戒斷模型。該實驗擬建立SH-SY5Y嗎啡依賴戒斷模型，探討血清濃度和納洛酮濃度對ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化表達的影響，以期確證影響ERK磷酸化表達的關鍵因素，為今后研究嗎啡依賴及戒斷機制提供適當的方法。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器DMEM/F12(11)培養基和青、鏈霉素均購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司(批號N×L0742)；胎牛血清(FBS)購自上海依科賽生物制品有限公司(批號120502)；抗β-actin抗體 (兔抗人)、抗p-ERK1/2、p-p38和p-JNK抗體(兔抗人)購自Cell Signalling Technology公司；蛋白酶抑制劑(Cat.No.04 693 116 001)、磷酸酶抑制劑(Cat. No.04 906 845 001 )均購自Roche公司；鹽酸納洛酮注射液(貴州聯合西創藥物有限公司，批號20110601)；鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號110111-2)。其他試劑均為國產分析純。CJ-2F超凈工作臺(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，Z-323型高速冷凍離心機(德國HERMLE公司)。

1.2細胞來源、培養及分組SH-SY5Y細胞由北京宣武醫院惠贈，在含有體積分數10%的FBS、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12(11)培養基中，于37 ℃、體積分數為5% CO2孵箱中培養。細胞的凍存、復蘇、傳代按照常規方法進行。取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以(1～3)×105個/孔接種于6孔板中，分別設無血清培養組和有血清培養組。待細胞生長達80%～90%融合時，無血清培養組以不含血清的DMEM/F12(11)培養基作用10 h后，加入10 μmol/L的嗎啡孵育48 h后，戒斷組給予10 μmol/L的納洛酮戒斷10、30和60 min，空白對照組不經嗎啡處理，嗎啡組用嗎啡孵育48 h后不經納洛酮處理；或者用10 μmol/L的嗎啡孵育48 h后，戒斷組以5、10和30 μmol/L納洛酮戒斷10 min。有血清培養組與上述培養過程完全一致，僅在培養過程中加入體積分數10%FBS。

1.3p-ERK1/2、p-p38和p-JNK蛋白表達的Westernblot檢測棄去6孔板中的培養液，冰浴的PBS洗2次，加入細胞裂解液 (每孔加入100 μL RIPA裂解緩沖液、4 μL 蛋白酶抑制劑、10 μL磷酸酶抑制劑) 冰上裂解30 min。然后，利用冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清。采用BCA法測定樣品中總蛋白質的含量，調整上樣量為30～40 μg。利用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并轉移至PVDF膜上。脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗(兔抗人p-ERK1/2、p-p38和p-JNK抗體均按11 000稀釋) 4 ℃過夜。TBST漂洗3次，10 min/次，加入二抗(按110 000稀釋，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體)室溫孵育2 h。再次以TBST漂洗3次，10 min/次，ECL顯色，利用軟件Image pro plus 6.0比較條帶的積分光密度。

1.4統計學處理采用SPSS 15.0進行分析，應用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較各組光密度值的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1有和無血清培養對10μmol/L納洛酮戒斷不同時間后SH-SY5Y細胞中p-ERK1/2表達的影響見圖1和表1。

圖1 有(上)和無(下)血清培養對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時間SH-SY5Y細胞中p-ERK1/2表達的影響

表1 有和無血清培養對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時間SH-SY5Y細胞中p-ERK1/2表達的影響

*:與嗎啡組比較，P<0.05。

2.2有和無血清培養對不同濃度納洛酮戒斷SH-SY5Y細胞中p-ERK1/2表達的影響見表2。

表2 有和無血清培養對不同濃度納洛酮戒斷SH-SY5Y細胞中p-ERK1/2表達的影響

*:與嗎啡組比較，P<0.05。

2.3有和無血清培養對10μmol/L納洛酮戒斷不同時間SH-SY5Y細胞中p-p38、p-JNK表達水平的影響見圖2，表3、4。

圖2 有和無血清培養對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時間SH-SY5Y細胞中p-p38(上)、p-JNK(下)表達水平的影響

表3 有和無血清培養對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時間SH-SY5Y細胞中p-p38表達的影響

*：與嗎啡組比較，P<0.05；△：戒斷組間兩兩比較，P<0.05。

表4 有和無血清培養對10 μmol/L納洛酮戒斷SH-SY5Y細胞中p-JNK表達的影響

*：與嗎啡組比較，P<0.05；△：戒斷組間兩兩比較，P>0.05。

3 討論

該實驗成功建立了SH-SY5Y細胞嗎啡依賴戒斷模型。結果顯示納洛酮戒斷能誘發無血清培養組細胞ERK1/2磷酸化水平的瞬時升高，戒斷后10 min時達峰值，接著迅速恢復至基值水平；而有血清培養組細胞則表現出ERK1/2磷酸化水平的持續升高，從戒斷后10 min一直持續到60 min。在無和有血清培養條件下，納洛酮戒斷均引起p38磷酸化水平時間依賴性遞增，也能引起JNK磷酸化水平的增加，但戒斷不同時間點之間JNK磷酸化水平差異無統計學意義。

Burgess等[10]研究表明血清能劑量依賴性地上調ERK1/2的磷酸化水平。Lee等[7]也發現FBS能在短時間內(2 min)上調ERK1/2的磷酸化水平，并導致p-ERK由胞質轉位至胞核，而MEK特異抑制劑U0126能夠顯著抑制FBS引起的ERK1/2蛋白磷酸化。作者的研究也證實了這一點，體積分數為10% FBS確實能明顯增加p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的水平。

關于ERK參與嗎啡成癮及戒斷過程的報道很多，但作者發現在動物模型中針對嗎啡調節ERK磷酸化研究在不同對象中研究結果并不一致，甚至在同一對象不同腦區的研究結果也不一致[1,11]。這就表明嗎啡與ERK的作用是一復雜的信號轉導過程。但較為一致的是，納洛酮戒斷后均表現出ERK的磷酸化水平急劇升高。在細胞模型中，也有各種不同的結果[12-14]。近年來的研究[3]結果顯示，體積分數0.5%FBS條件下培養SH-SY5Y細胞，1 μmol/L嗎啡作用72 h能引起ERK1/2磷酸化水平降低，3 μmol/L納洛酮戒斷10 min后進一步降低，但隨著時間延長，又逐漸恢復升高。有學者[4]發現，體積分數10%FBS條件下培養SH-SY5Y細胞，1 μmol/L芬太尼作用60 min內ERKs磷酸化水平沒有明顯變化，慢性作用7 d沒有明顯變化，10 μmol/L納洛酮戒斷也沒有明顯變化。 Ferrer-Alcon等[5]也發現體積分數10%FBS條件下培養SH-SY5Y細胞，1 μmol/L嗎啡作用1～60 min，3 min后就能檢測到ERK磷酸化水平的明顯升高，30 min達峰值，60 min時則恢復至基值水平。作者在實驗中也發現血清對細胞嗎啡依賴模型中ERK1/2磷酸化表達時程有明顯影響，血清能明顯延長ERK1/2磷酸化高表達持續時間。作者還發現5～30 μmol/L的納洛酮對ERK1/2磷酸化表達時程并無明顯影響。由此作者推測，影響SH-SY5Y細胞嗎啡依賴戒斷模型中ERK1/2磷酸化表達的主要影響因素為血清。

JNK、p38MAPK通路是與ERK1/2并行的MAPKs信號通路。研究[15]表明，哺乳類細胞可以通過多種機制維持其每一條MAPKs信號通路轉導的特異性。即使在細胞凋亡過程中ERK1/2與JNK、p38也表現出相反的作用[16-17]。研究[13]顯示，納洛酮催促嗎啡戒斷能誘導多個區域ERK1/2磷酸化的高表達，但對JNK和p38磷酸化沒有明顯影響。作者的實驗結果顯示，納洛酮能誘發ERK1/2、JNK和p38蛋白磷酸化水平高表達，但對其表達時程的影響并不一致，有血清培養能明顯延長p-ERK高表達持續時間，由此可見，血清因素對研究納洛酮嗎啡戒斷ERK1/2磷酸化表達有明顯影響，而不同濃度納洛酮戒斷對ERK1/2磷酸化水平沒有明顯影響，這就為進一步在SH-SY5Y細胞中探索納洛酮戒斷機制提供了方法學依據。

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