rhG-CSF對缺氧SH-SY5Y細胞及大鼠缺血腦組織中LAMP-2a和HSC-70蛋白表達的影響*

田 婧，王雪晶，馬耀華，荊 婧，鄧文靜，蘇 楠，滕軍放

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)是一種造血營養因子。近些年研究[1]發現rhG-CSF在腦缺血中發揮保護作用。自噬是細胞膜結構發生動態的形態學改變，并通過溶酶體介導蛋白質和細胞器降解的過程，分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。CMA是組成型熱休克蛋白70(heat shock cognate protein 70, HSC-70)作為分子伴侶參與的細胞自我吞噬，對于機體保持內環境穩定具有重要意義[2]。已有研究[3-4]顯示rhG-CSF可調控CMA。2006年Takemura等[3]發現rhG-CSF的心臟保護作用是通過對抗自噬性細胞凋亡實現的。2012年Jacquel等[4]發現CMA參與rhG-CSF介導的單核細胞向巨噬細胞的轉化。作者觀察了rhG-CSF對缺氧人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞及缺血缺氧大鼠腦缺血周邊區組織CMA標志性蛋白LAMP-2a及HSC-70表達的影響，探討rhG-CSF抑制缺血缺氧后神經元損傷的機制，為rhG-CSF治療腦卒中提供更多依據。

1 材料與方法

1.1細胞實驗

1.1.1 缺氧細胞模型的制備及處理 SH-SY5Y細胞由中南大學唐北沙教授饋贈。將SH-SY5Y細胞置于37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度培養箱培養。取對數生長期細胞，換用預先以無氧混合氣體(VN2：VCO2=955)填充30 min的無糖DMEM培養液，將細胞立即置于無氧混合氣體填充的缺氧培養箱中，37 ℃、飽和濕度條件下培養6 h，制備成氧糖剝奪模型。然后將細胞接種在正常培養皿，分為3組，分別加入0、100、200 μg/L的rhG-CSF，繼續培養48 h。

1.1.2 細胞HSC-70、LAMP-2a蛋白測定 經rhG-CSF孵育48 h后的細胞以裂解液裂解，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，采用二辛可寧酸法行蛋白質定量檢測，然后提取總蛋白 25 μg，采用SDS-PAGE電泳，轉膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，加入一抗(抗人HSC-70抗體按1500稀釋、LAMP-2a抗體按1800稀釋、GAPDH抗體按15 000稀釋)，4 ℃過夜。次日加入過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，置于水平脫色搖床上孵育2 h，ECL光化學法顯色，暗室中行X線膠片曝光。使用凝膠分析系統分析，測定各條帶的光密度值，以目的條帶與內參GAPDH光密度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2動物實驗

1.2.1 實驗動物分組 SD大鼠54只，體質量280～320 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分為3組，每組18只。假手術組僅進行頸部手術，不栓塞大腦中動脈，實驗組及模型組均制備大腦中動脈栓塞模型[5]。術后2 h實驗組給予rhG-CSF(50 μg·kg-1·d-1)注射5 d，模型組和假手術組給予等量生理鹽水。各組大鼠使用300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，經心尖至升主動脈入路，依次用生理鹽水和40 g/L甲醛溶液各200 mL灌注，然后斷頭完整取腦。

1.2.2 大鼠腦缺血周邊區組織HSC-70、LAMP-2a蛋白測定 取0.1 g腦缺血周邊區組織，PBS漂洗3次，加入裂解液后勻漿，然后轉入EP管中超聲，離心后收集上清。用考馬斯亮藍法測量蛋白濃度，采用Western blot法檢測HSC-70和LAMP-2a，操作同1.1.2。

1.2.3 大鼠腦缺血周邊區組織MAP-2蛋白檢測 取腦缺血周邊區組織，切片脫水、石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水后，體積分數3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性，50 g/L小牛血清封閉，室溫孵育30 min，滴加1200稀釋的MAP-2多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加HRP標記的二抗，PBS漂洗后，DAB顯色，常規脫水透明，樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 大鼠神經功能評價 模型建立后在動物蘇醒后即刻及術后第7天，由不了解動物分組的人員參照改良神經功能缺損評分方法對3組大鼠進行神經功能評價，總分18分，分值越高，損傷越嚴重。

1.3統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。采用單因素方差分析比較3組細胞HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達及3組大鼠HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達，采用LSD-t檢驗行組間兩兩比較；采用兩獨立樣本的t檢驗比較模型組和實驗組兩個時間點神經功能缺損評分的差值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達結果見圖1、表1。

圖1 不同質量濃度rhG-CSF對細胞HSC-70、LAMP-2a蛋白表達水平的影響

表1 不同質量濃度rhG-CSF對細胞HSC-70、LAMP-2a蛋白表達水平的影響

*：與0 μg/L組比較，P<0.05；#：與100 μg/L組比較，P<0.05。

2.2 3組大鼠腦缺血周邊區組織HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達結果見圖2、表2。

2.3 3組大鼠腦缺血周邊區組織MAP-2蛋白的表達與模型組相比，實驗組可見密集、粗大、呈叢狀的MAP-2免疫反應陽性的樹突，見圖3。

圖2 大鼠腦缺血周邊區組織HSC-70、LAMP-2a 蛋白的表達

表2 3組大鼠腦組織中HSC-70、LAMP-2a 蛋白的表達水平

*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

圖3 MAP-2免疫組化染色結果(SP，×400)

2.4 3組大鼠神經功能評價假手術組術后蘇醒時及術后第7天神經功能正常，神經功能缺損評分為0。模型組與實驗組兩個時間點神經功能缺損評分比較見表3。

表3 模型組與實驗組兩個時間點神經功能缺損評分

*：t=6.322,P<0.001。

3 討論

以往研究發現，rhG-CSF可以動員骨髓干細胞向腦梗死部位遷移，并向神經細胞分化，替代受損傷的神經細胞，同時通過促進病變腦組織的血管生成，改善局部血流量，促進神經營養因子分泌及抑制炎性反應，從而發揮腦保護作用[6]。作者觀察rhG-CSF對缺氧SH-SY5Y細胞及缺血缺氧大鼠腦缺血周邊區組織CMA標志性蛋白LAMP-2a及HSC-70表達的影響，探討rhG-CSF抑制缺血缺氧后神經元損傷的機制。

HSC-70為熱休克蛋白70家族成員之一。LAMP-2a為表達在溶酶體膜上的單次跨膜蛋白。CMA的過程是當細胞受到氧化性損傷時，細胞內蛋白暴露出KFERQ序列，被作為分子伴侶的HSC-70識別結合，形成分子伴侶-底物復合物，然后引導該復合物到達溶酶體并與溶酶體膜上的LAMP-2a結合，將損傷的蛋白質等運輸到溶酶體內降解[7-8]。

該研究證實，在細胞及動物模型水平rhG-CSF均可上調HSC-70與LAMP-2a的表達，說明rhG-CSF提高了缺氧細胞及缺血缺氧后大鼠腦組織CMA的水平，但rhG-CSF上調CMA的機制尚不明確。在巨自噬的研究[9]中已證實在腦出血中，NF-κb特異性抑制劑SN50通過抑制NF-κb信號通路在一定程度上促進了腦出血后巨自噬相關蛋白的表達上調。rhG-CSF可抑制NF-κb，那么rhG-CSF是否通過抑制NF-κb而上調CMA的活性有待進一步研究。

該研究的動物實驗部分在證實rhG-CSF上調缺血缺氧后腦組織CMA活性的同時，還發現使用rhG-CSF后神經元內MAP-2表達增加，神經功能得到改善。MAP-2為存在于樹突中的神經元標志性骨架蛋白，可反映神經元代償修復及神經干細胞定向分化為神經元的狀況。因此rhG-CSF可能通過上調CMA在腦缺血中發揮神經保護作用。原因考慮如下：首先，CMA上調可選擇性地清除由某些病毒、病原體及錯誤折疊而形成的凝聚蛋白或受損的細胞器，有利于神經功能恢復及內環境的穩定[10]。其次，上調自噬可促進細胞分化。在低等生物中，自噬可參與酵母孢子的形成和分化[11]。在血液系統中，自噬可參與單核細胞向巨噬細胞的轉化[12]。在神經系統中，自噬上調可促進神經干細胞分化為神經細胞，所以自噬的上調可以促進神經功能恢復[9]。rhG-CSF動員到達腦缺血區的骨髓間充質干細胞分化為神經細胞，可能與其上調CMA促進細胞分化有關?？傊?，CMA的上調可能從多個途徑發揮神經保護功能。

綜上所述，該研究通過動物及細胞實驗證實在缺血缺氧損傷中，rhG-CSF能上調CMA。腦缺血中rhG-CSF可能通過上調CMA發揮神經元保護作用，這為rhG-CSF的臨床應用提供了更多的理論依據。

[1] 史建軍,付宏亮.粒細胞集落刺激因子對大鼠急性缺血性腦梗死的神經保護作用[J].中國藥物與臨床,2009,9(5):372

[2] Kon M,Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy in health and disease[J]. FEBS Lett,2010, 584(1): 1399

[3] Takemura G,Miyata S,Kawase Y,et al.Autophagic degeneration and death of cardiomyocytes in heart failure[J].Autophagy, 2006,2(3):212

[4] Jacquel A,Obba S,Boyer L,et al. Autophagy is required for CSF-1-induced macrophagic differentiation and acquisition of phagocytic functions[J].Blood, 2012, 119(19):4527

[5] 汪飛,儲照虎.線栓法大鼠大腦中動脈閉塞模型的制備[J].基層醫學論壇,2011,15(1)：14

[6] 程鶴云,滕軍放,郭利利.重組人粒細胞集落刺激因子對急性缺血再灌注腦損傷大鼠腦組織Egr-1、Survivin 蛋白表達及血管再生的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2013, 48(2):200

[7] 陶伍元，張文武.HSP70與膿毒癥[J]. 中國實用內科雜志，2010，30(增刊 1)：88

[8] Massey AC,Kaushik S, Sovak G,et al. Consequences of the selective blockage of chaperone-mediated autophagy[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(15):5905

[9] 孫玉霞,包海軍,劉偉麗,等.小鼠腦出血后自噬相關蛋白表達及NF-κb信號通路對其調節作用的研究[J].蘇州大學學報:醫學版,2011, 31(1):30

[10]Orenstein SJ,Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy:molecular mechanisms and physiological relevance[J].Semin Cell Dev Biol,2010,21(7):719

[11]Juhasz G,Csikos G,Sinka R.The Drosophila homology of Aut1 is essential for autophagy and development[J]. FEBS Lett, 2003,543(13):154

[12]王卓.自噬調節全反式維甲酸誘導髓系白血病細胞分化的機制研究[D].長沙:中南大學,2011.