辛伐他汀對膿毒癥大鼠心肌細胞核因子－κB、誘導型一氧化氮合酶表達的影響及意義

張立濤 李素彥 許 寧 趙鶴齡(河北省人民醫院急診科，河北 石家莊 05005)

膿毒癥早期就已存在心肌器質性損傷，且發生率很高，其機制復雜，其中一氧化氮(NO)在膿毒癥心肌損傷過程中發揮了重要作用。核因子(NF)-κB是一種廣泛存在于體內細胞的核轉錄因子，NF-κB信號通路的過度活化與人類疾病的發生關系密切。膿毒癥時NF-κB活性的增高調控iNOS的在心肌細胞中表達增加，可能是心肌損傷發生的機制之一。他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑是一種廣泛應用的降脂藥物，并可以減少患冠心病的風險。除此之外，他汀類藥物尚有與降低血脂無關的多種生物作用，這種多效性包括:抗炎作用、免疫調節、抗氧化、抗凝血、穩定血管內皮等，膿毒癥患者的功能異常往往就表現在以上幾個方面，因此理論上他汀類藥物可以改善膿毒癥患者的預后。本實驗，觀察膿毒癥模型大鼠心肌細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)與NF-κB的表達，并評價辛伐他汀對二者表達的影響及意義，進一步探討辛伐他汀的心臟保護性作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 30只雌性Wistar大鼠，由河北醫科大學實驗動物中心提供，體重250～270 g。采用盲腸結扎穿孔法(CLP)〔1〕建立膿毒癥模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實驗臺上。常規消毒腹部皮膚，于腹部皮膚正中做切口，長約2 cm，打開腹腔后小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。盲腸如有糞便，則輕輕將其擠向與其相連的大腸，在盲腸與小腸及大腸交界處，用4-0號絲線環形結扎盲腸，避免結扎回腸和盲腸系膜血管。結扎完畢后仔細檢查，保持腸道通路暢通。在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用18號針頭穿刺三次，擠出適量腸內容物，并留置一寬約0.2 cm，長約3 cm橡皮引流條貫通盲腸，以防針孔閉合，輕輕將腸管放回原處，逐層縫合，關閉腹腔。

1.2 動物分組及處理 雌性Wistar大鼠30只，正常喂養，經1 w適應期后利用隨機數字表分為正常組(N組)10只，造模組(CLP組)10只，辛伐他汀組(S組)10只。S組開始喂養辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙東，批號:國藥準字H19990366)，用生理鹽水配成等濃度藥液灌胃(5 mg/ml)，每天1次，持續2 w。正常組和造模組用生理鹽水灌胃(4 ml/kg)，每天1次，持續2 w。2 w后造模組及辛伐他汀組行盲腸結扎穿孔術，各組于術后48 h分別取大鼠左心室心肌組織，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋。

1.3 試驗方法 iNOS一抗為兔抗大鼠IgG多克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶200。NF-κB p65一抗為小鼠抗大鼠IgG單克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶80。DAB顯色，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.1 標本HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟至水→蘇木素染色5 min，流水沖洗數次→1%鹽酸酒精分化20 s，1/400氨水返藍，間以流水沖洗1 min→伊紅染色5 min，流水沖洗30 s→梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片→光鏡下讀片。

1.3.2 S-P三步法免疫組織化學法染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min→蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min→盛有枸櫞酸鹽酸緩沖液的高壓鍋中進行高壓抗原熱修復10 min→3%H2O2室溫孵育 5～10 min，PBS沖洗，2 min×3次→5% ～10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，37℃ 孵育2 h→PBS沖洗，2 min×3次→滴加1%BSAPBS稀釋的生物素標記二抗，37℃ 孵育10～30 min→PBS沖洗，2 min×3次→滴加PBS稀釋的辣根酶標記鏈霉卵蛋白素，37℃ 孵育15 min→PBS沖洗，2 min×3次→DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水透明、封片。

1.3.3 染色結果的判定 iNOS陽性染色為在細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒沉著。NF-κB p65陽性染色為在細胞質(部分在細胞核)內出現黃色或棕黃色顆粒沉著。陽性細胞必須具備:①細胞結構清晰;②陽性顆粒定位、定性好;③著色明顯高于背景。評分標準:參照Soslow〔2〕的評分方法，應用美國多功能真彩色細胞圖像分析管理系統分析:每張切片隨機取5個(×200)高倍視野，采用陽性細胞顯色強度和陽性細胞百分比雙重判定進行評分，并將二者評分乘積作為最終評分進行統計學分析。

1.4 統計學方法 使用SAS8.0統計軟件分析。等級資料采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗及兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況 CLP組大鼠術后表現出無活力，反應差，發紺，立毛和呼吸急促的特點。打開腹腔后可見血性腹水，可聞及惡臭味，并發現部分大鼠腸管水腫，盲腸發黑，可見膿苔。相比之下，S組大鼠表現相對較輕。

2.2 HE染色結果 N組大鼠心肌纖維結構正常。CLP組大鼠心肌纖維水腫，疏松，間質充血水腫，部分可見淀粉樣變性。心內膜內皮細胞部分腫脹，局部脫落，缺損。而S組心肌的組織病理學改變相比CLP組較輕，見圖1。

2.3 免疫組織化學染色結果

2.3.1 iNOS的表達 N組大鼠心肌細胞iNOS蛋白表達微量。CLP組大鼠心肌細胞胞漿內可見較多棕黃色或棕色顆粒沉著，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細胞胞質內棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統計學意義(P＜0.05)，與N組相比無明顯差異(P＞0.05)。見圖2，表1。

2.3.2 NF-κB的表達 N組大鼠心肌細胞NF-κB蛋白表達微量。CLP組大鼠心肌細胞胞漿內可見棕黃色或黃色顆粒沉著，部分細胞核黃染，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細胞胞漿內棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統計學意義(P＜0.05)，與 N組相比無明顯差異(P＞0.05)。見圖3，表2。

表1 各組大鼠心肌組織iNOS(n，n=10)

表2 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(n，n=10)

圖1 各組大鼠心肌組織病理學點(HE，×200)

圖2 各組心肌組織iNOS表達(DAB，×200)

圖3 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(DAB，×200)

3 討論

3.1 膿毒癥模型的建立 建立標準化的膿毒癥動物模型是探索膿毒癥病理生理學機制和防治措施的重要環節，在膿毒癥研究領域具有舉足輕重的作用。膿毒癥動物模型目前常用的有內毒素誘導、細菌注射、腹膜炎模型即盲腸結扎穿孔模型等方法。用CLP方法造模，炎癥部位是否被大網膜包裹關系到膿毒癥動物模型的成功與否，并與實驗者手術方法(如穿孔大小、盲腸結扎程度)和動物的種系、年齡、性別有關，人為控制存在一定困難，但是該模型操作起來相對簡便，通過外科手術而引起腹腔感染，與臨床上化膿性闌尾炎穿孔形成的腹膜炎相似。本實驗采用CLP法復制大鼠膿毒癥模型，使有菌的腸內容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發廣泛的全身性炎性反應。根據術后大鼠的表現及處死后解剖所見，符合膿毒癥動物模型的基本要求〔3〕，因此，利用此模型進行研究更具說服力，更貼近臨床。

3.2 膿毒癥時心功能異常的特征與機制 Waisbren等〔4〕最早在臨床發現由于膿毒癥所導致的心臟功能異常的現象，雖然膿毒癥患者心輸出量大致正常，但是每搏量和射血分數明顯降低〔5〕，一旦膿毒癥患者出現心臟功能異常，其死亡率會明顯增加。Natanson等〔6〕對犬膿毒癥模型的研究發現膿毒癥時其心臟的收縮與舒張功能都受到明顯抑制。目前，大量臨床〔7，8〕與基礎〔9〕研究證明，心肌收縮力的降低與順應性的下降是膿毒癥時心臟功能異常的主要原因。雖然右心室與左心室在結構及功能上有一定的差異，但在膿毒癥過程中其功能障礙與左心室表現基本相似〔10〕。雖然關于膿毒癥時心臟功能異常機制的研究取得巨大進展，但其確切機制至今仍不明確，這其中涉及多種因素，包括:心肌抑制物、細胞因子、一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)和前列腺素類物質的作用等，其中大量研究發現高水平的NO可以抑制心肌收縮功能。

NO在心血管系統內發揮著復雜的生物學效應。其可以在不同的生理和病理生理條件下調整心臟的功能。許多實驗表明高劑量的NO對心肌收縮功能具有抑制作用。Brady等〔11〕研究發現給豚鼠腹腔注射內毒素，4 h后取出心臟，測定心室肌細胞的收縮性，發現心肌細胞收縮力明顯下降。這種作用可被一氧化氮合酶(NOS)抑制劑N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)所逆轉，提示內毒素激活NOS可產生NO，而抑制心肌收縮力。另外作者〔12〕給正常的豚鼠離體心室肌細胞直接應用NO及NO供體硝普鈉，也出現了心肌細胞收縮功能的減退，直接證明了NO對心肌收縮功能的抑制作用，并認為這與NO影響心肌細胞環鳥苷酸的產生有關。Kelm等〔13〕則證實高劑量的NO對心肌收縮力的影響與其抑制心肌細胞能量產生有關。

NO是在NOS催化左旋精氨酸轉變為左旋瓜氨酸的過程中合成的。NOS有三個亞型，包括神經型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)。iNOS在體內分布較廣，已證實心肌組織中許多成分如心肌細胞、心臟微血管的內皮細胞、平滑肌細胞以及心內膜內皮細胞都有分布。Wagner等〔14〕發現 iNOS可以在細胞因子如 IL-1β、TNFα、IFNγ、IL-6 等的刺激下經由細胞內NF-κB系統與信號轉導因子和轉錄激活因子(STAT)信號轉導通路調控合成，并產生大量NO。本實驗通過應用免疫組化的方法對膿毒癥大鼠心肌細胞的研究發現:造模后48 h，心肌細胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達明顯增加，因此認為與CLP后炎癥因子激活NF-κB系統使iNOS表達增加有關，并因此造成模型大鼠心肌細胞受損。

3.3 他汀類藥物抗膿毒癥作用 他汀類藥物抗膿毒癥作用機制較為復雜，同時也是多方面的，包括抗炎、抗凝血、調節細胞免疫、改善內皮細胞功能、抗氧化應激反應等效應。Merx等〔15〕采用CLP法復制小鼠膿毒癥模型，結果表明，經過他汀類藥物預處理的小鼠平均存活率是對照組的4倍。Chaudhry等〔16〕發現西立伐他汀可以明顯降低由脂多糖所誘導的小鼠促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，加快細菌清除，提高小鼠的生存率。他汀類藥物同時可以改善膿毒癥時腎臟〔17〕和心臟功能〔18〕。

Huang等〔19〕在對LPS和IFN-γ刺激后的小鼠巨噬細胞的研究發現，洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀可以抑制巨噬細胞iNOS的表達，并認為這與他汀類藥物可以抑制NF-κB活性和STAT-1磷酸化有關。Wagner等〔14〕對細胞因子刺激后的大鼠胸主動脈內皮細胞的研究發現，阿托伐他汀可以減弱內皮細胞NF-κB和STAT-1的核轉運，使iNOS的表達減少。Madonna等〔20〕對經TNF-α和IL-1刺激后的大鼠心臟胚胎細胞的研究發現，辛伐他汀可以提高NF-κB的抑制物IκB水平，并減少其細胞核內NF-κB含量，因此減少iNOS mRNA及iNOS蛋白的表達。本實驗中經辛伐他汀預處理的大鼠在造模后48 h，心肌細胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達較造模組明顯減少，考慮與辛伐他汀抑制NF-κB的活性，進而降低iNOS在心肌細胞的表達有關，因此理論上20 mg/kg辛伐他汀可以減少膿毒癥大鼠心肌細胞NO的產生，起到心肌保護性作用。

本研究主要通過免疫組化的方法研究辛伐他汀對膿毒癥大鼠的心肌保護性作用，受研究方法與樣本數所限，結果存在一定局限性。同時20 mg/kg的辛伐他汀的劑量只是參考相關文獻進行的探索性實驗，因此其他劑量與種類的他汀類藥物的實驗效果有待進一步研究。

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