小RNA技術干擾p21聯合環磷酰胺對HepG2細胞增殖及凋亡的影響

劉紅云，包永芬，單士剛

(1湖北科技學院基礎醫學院醫學免疫學教研室，咸寧 437100;2湖北科技學院基礎醫學院醫學微生物學教研室;3湖北科技學院基礎醫學院醫學細胞生物學與遺傳學教研室;*通訊作者，E-mail:ssgang121@163.com)

P21蛋白是調控細胞周期的抑制蛋白，在調節細胞增殖中起非常重要的作用，其基因缺失、失活與多種腫瘤的發生、發展及預后有關［1］。近年來，在癌癥治療當中使用的很多新型抗癌藥物、放射療法、基因療法等都與p21有著密切的聯系，比如:在驗證p21基因高表達的人胃癌細胞系對化療藥物的敏感性實驗中，p21基因可提高靶細胞對5-FU的敏感性［2］。癌癥的發生、發展是癌基因的激活和/或抑癌基因失活的結果，是多因素、多基因參與引起的，抑癌基因在此起到負性調控的作用。而且，p21基因表達與否與肝細胞癌發生、發展的相關性尚需完善。鑒于此，本研究通過小RNA干擾技術抑制肝癌細胞系HepG2中p21基因的表達，同時聯合化療藥物環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)觀察其聯合作用對HepG2細胞增殖及細胞凋亡效應的影響，為臨床應用提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

人肝癌細胞系HepG2購買于武漢大學中國典型培養物保藏中心。胎牛血清、DMEM培養基為美國Gibco公司產品。CTX和四甲基氮唑藍(methythiazoletrazolium，MTT)購自美國 Sigma公司。p21基因siRNA序列由上海生物工程有限公司設計并合成。細胞裂解液、caspase-3、caspase-9和caspase-6活性檢測試劑盒均購自美國R＆D公司。細胞凋亡檢測試劑盒為杭州聯科生物技術有限公司產品。脂質體轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術有限公司。小鼠抗人β－actin一抗、小鼠抗人p21一抗和羊抗鼠二抗均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HepG2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，經0.25%胰蛋白酶消化傳代后在含5%CO2的37℃培養箱內培養，每2 d傳代一次。

1.2.2 小RNA對p21的抑制作用 采用Western blot方法檢測P21蛋白表達情況。選處于對數生長期的HepG2細胞制備成單細胞懸液(3.0×105/ml)接種在24孔培養板中，每孔1 ml細胞懸液，待細胞貼壁后，參照轉染試劑說明書進行RNA干擾實驗，設3個實驗組:空白對照組(不加小RNA序列);小RNA處理組(加小RNA序列);陰性對照組(加陰性對照小RNA)。轉染36 h后收集HepG2細胞。在上述三組細胞中加入150μl細胞裂解液裂解細胞后，按照試劑盒要求提取總蛋白，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，取不同組別的等量蛋白樣品進行電泳，然后依次轉膜、封閉、一抗二抗孵育和洗滌(其中一抗稀釋濃度為1∶400;二抗稀釋濃度為1∶5 000)后，ECL顯色曝光并通過X線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描并測定各組蛋白條帶的相對表達量。

1.2.3 MTT試驗 選處于對數生長期的HepG2細胞制備單細胞懸液，以每孔3.0×103個細胞接種于96孔培養板。CTX濃度參考本課題組預實驗結果，選用10μg/L。細胞隨機分成5組:①空白對照組;②陰性對照組(陰性小RNA序列);③干擾組(加p21小RNA序列);④CTX組(2 mg/L CTX處理);⑤聯合組(p21小RNA序列+10μg/L CTX處理)，每孔細胞設8個復孔。按文獻［2］所述實驗步驟，在處理24 h后，測定540 nm處的吸光度OD值，計算細胞增殖百分率［實驗組OD值/對照組OD值×100%］。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 HepG2細胞按1.2.3所述方法處理24 h后，常規洗滌消化，離心收集細胞制備成濃度為5.0×106/ml單細胞懸液，取 100μl細胞懸液，加入 400μl 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5μl AnnexinⅤ-FITC和10μl PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡變化情況。

1.2.5 采用Elisa方法測定HepG2細胞caspase-3、caspase-9和caspase-6活性 HepG2細胞按1.2.3所述方法處理24 h后，按照1.2.2所述方法提取總蛋白，caspase-3、caspase-9和caspase-6活性具體檢測方法參照試劑盒說明書的描述進行。測定實驗體系在405 nm處的吸光度OD值，確定各組細胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6的活化水平。

1.3 統計學分析

所獲數據均采用SPSS13.0版軟件包進行統計學處理，實驗數據以±s表示，組間均數比較用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p21靶向小RNA序列對HepG2細胞p21的沉默效率

Western blot結果表明，小RNA干擾組P21蛋白表達水平顯著低于空白對照組和陰性對照組(P＜0.01);而陰性對照組與空白對照組P21蛋白表達水平比較則差異無統計學意義(P＞0.05，見圖1)。

圖1 Western blot檢測HepG2細胞中P21蛋白表達Figure 1 Expression of P21 protein in HepG2 cells by Western blot

2.2 細胞增殖率檢測結果

相對于空白對照組和陰性對照組，干擾組、CTX組和聯合組細胞增殖率顯著降低(P＜0.01);同時，聯合組細胞增殖率相對于CTX組亦明顯降低(P＜0.01，見圖2)。

2.3 細胞凋亡分析結果

相對于空白對照組和陰性對照組，干擾組、CTX組和聯合組凋亡細胞百分率顯著升高(P＜0.01);同時，聯合組凋亡細胞百分率相對于CTX組亦顯著升高(P＜0.01，見圖3)。

圖2 經不同處理后HepG2細胞增殖率變化(±s).Figure 2 Changes of HepG2 cell proliferation after different treatments(±s)

圖3 經不同處理方式后HepG2細胞凋亡百分比變化(±s)Figure 3 Changes of HepG2 cell apoptosis after different treatments(±s)

2.4 caspase-3、caspase-9 和caspase-6 活化程度變化

相對于空白對照組和陰性對照組，干擾組、CTX組和聯合組細胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度均有顯著升高(P＜0.01);同時，聯合組細胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度亦明顯高于CTX組(P＜0.01，見表1)。

3 討論

表1 不同處理方式對HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影響(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

表1 不同處理方式對HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影響(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

與空白對照組和陰性對照組比較，*P＜0.01;與 CTX組比較，#P＜0.01

干擾組CTX 組 8.560 9±0.45* 6.923 1±0.30* 5.265 1±0.15*聯合組 10.281 9±0.23*#7.624 1±0.14*#6.016 2±0.25*#

DNA損傷引發的細胞凋亡是目前臨床應用DNA烷化劑類化療藥物發揮抗癌作用的普遍分子機制［3］。當DNA損傷可激活抑癌基因p53，活化的p53可以在轉錄水平啟動p21的表達，作為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21可以通過抑制細胞周期中DNA的合成過程，使細胞周期阻滯在S期，進而使受損細胞有充分的時間完成DNA修復，如修復不完全，細胞則通過啟動程序性細胞死亡即凋亡來防止受損DNA 傳遞到下一代［4，5］。因此，我們設想通過小RNA干擾技術抑制p21基因，使細胞周期調節通路p53-p21受阻，導致受損細胞無法及時完成DNA修復進而增強其對化療藥物的敏感性。

本實驗以肝癌細胞HepG2為研究對象，觀察p21沉默聯合CTX處理對HepG2細胞的生物學作用，檢驗p21沉默在肝癌治療中的作用及可行性。細胞增殖率和流式細胞術結果顯示，相對于空白對照組和陰性對照組，干擾組、CTX組和聯合組細胞凋亡率顯著上升，同時，聯合組細胞凋亡率亦明顯高于CTX組，提示在本研究中，p21沉默和CTX處理兩者聯合應用有明顯的協同作用。caspase家族成員是啟動和執行哺乳動物細胞凋亡關鍵蛋白因子，細胞凋亡發生時，caspase-9為凋亡始動因子，可以在其他凋亡因子參與下發生自我活化并激活下游凋亡執行因子caspase-3和caspase-6，后者則作用于特異性底物使細胞發生生化及形態學改變，導致細胞凋亡［6］。本研究表明，相對于 CTX組，p21小 RNA序列聯合 CTX處理可明顯增強 HepG2細胞中caspase-9、caspase-3和caspase-6的活化程度，又由于caspase-9是線粒體依賴性細胞凋亡的關鍵細胞因子［6］，提示線粒體在p21沉默對細胞凋亡的促進作用中發揮了關鍵作用。

綜上所述，本研究通過針對p21基因的小RNA序列有效地抑制了HepG2細胞中p21基因的表達，阻礙DNA損傷修復過程，而達到促進HepG2細胞凋亡的作用。因此，p21基因沉默結合傳統化療可能在肝癌的治療中具有潛在的應用價值。

［1］Hill R，Bodzak E，Blough MD，etal.p53 binding to the p21 promoter is dependent on the nature of DNA damage［J］.Cell Cycle，2008，7(15):2535－2543.

［2］曹巖，鄭永晨，黃穎.p21基因轉染人胃癌細胞對化療藥物敏感性的影響［J］.吉林大學學報:醫學版，2005，31(5):785－787.

［3］鄭長青，季守平，章揚培.DNA損傷修復與腫瘤烷化劑化療［J］.軍事醫學科學院院刊，2009，33(1):77－80.

［4］Zhang H，Hannon GJ，Beach D.p21-containing cyclin kinases exist in both active and inactive states［J］.Genes Dev，1994，8(15):1750－1758.

［5］Cazzalini O，Perucca P，Riva F，etal.p21CDKN1A does not interfere with loading of PCNA at DNA replication sites，but inhibits subsequent binding of DNA polymerase delta at the G1/S phase transition［J］.Cell Cycle，2003，2(6):596－603.

［6］趙瑞杰，李引乾，王會，等.Caspase家族與細胞凋亡的關系［J］.中國畜牧雜志，2010，46(17):73－78.