新型Schiff堿與DNA相互作用及其抗腫瘤活性研究

余英琳，廖向文，潘偉健，何榮偉，應 鵬，陸家政

(廣東藥學院藥科學院，廣州 510006;*通訊作者，E-mail:lujia6812@163.com.)

希夫堿(Schiff base)是指含有亞胺或甲亞胺基團的一類有機化合物。通常希夫堿是由胺和活性羰基縮合而成，具有優良液晶特性，可用做有機合成試劑和液晶材料等。希夫堿還具有殺菌、抑菌、抗癌、抗病毒以及載氧等特性而被廣泛應用在醫學、藥物等研究領域［1，2］。因其結構中的－C=N－鍵可提供孤對電子，希夫堿具有良好的配位能力。部分希夫堿金屬配合物顯示了顯著的抗癌活性，因此對希夫堿配合物的合成、篩選、結構與活性關系等研究引起了廣泛關注［3，4］。實驗表明，含 N，O 和含 N，S 給予體的希夫堿金屬配合物具有顯著的抗癌活性［5，6］。目前，已經篩選出一些具有高抗腫瘤活性且無明顯毒副作用的Schiff堿金屬配合物，但尚未實現應用于臨床治療［6，7］。

為尋找生物活性更好的新型Schiff堿，以進一步篩選低毒高效的抗腫瘤金屬配合物藥物提供新的依據，本文設計合成四種新型Schiff堿:2－羥基－1－萘甲醛縮氨基硫脲(HNTD)，水楊醛縮氨基硫脲(SATS)，水楊醛縮異煙肼(PAH)和2－羥基－1－萘甲醛縮異煙肼(PAHN)(結構見圖1);以元素分析、IR、ES-MS、1H-NMR和13C-NMR對化合物進行了表征。以紫外－可見分光光度法觀察了它們與DNA的相互作用，并采用MTT法體外測試了它們對不同種類人腫瘤細胞增殖的抑制效果。

1 材料與儀器

1.1 試劑

無水甲醇;無水乙醇;水楊醛;無水乙醚;1，10－菲咯啉;2，2’－聯吡啶(分析純，天津大茂試劑有限公司);異煙肼;2－羥基－1－萘甲醛;硫代氨基脲(分析純，上海晶純實業有限公司)。二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司，美國);CT-DNA(美國Sigma公司);四氮唑藍(MTT)和血清培養液實驗均為廣州瑞真生物有限公司產品;實驗采用的人神經瘤細胞(SH-SY5Y，SK-N-SH)和乳腺癌細胞(MCF-7)，均購于美國標準菌庫。

圖1 Schiff堿化合物的結構Figure 1 Structures of four Schiff bases

1.2 儀器

AUY220型萬分之一電子分析天平(鞏義市予華儀器有限公司);QZX－9140 MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海蘇達實驗儀器設備廠);HH－1型恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市宏華儀器廠);DZF－6050真空干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);DSA型超聲波清洗儀(深圳市佐泰超聲自動化設備有限公司);240Q型元素分析儀(Perkin-Elmer公司);Varian－500 Hz核磁共振儀(美國Varian INOVA公司);LCQ DECA XP離子阱電噴霧質譜儀(美國Thermo Finnigan公司);酶聯免疫檢測儀(GENIOSTECAN);CO2培養箱(日本三洋公司)。

2 方法與結果

2.1 化合物的合成與表征

2.1.1 2－羥基－1－萘甲醛縮氨基硫脲(HNTD)的合成與表征 將硫代氨基脲(0.455 0 g，5 mmol)和30 ml無水甲醇加入100 ml三口燒瓶中，升溫至50℃加熱攪拌30 min。待硫代氨基脲全部溶解后，緩慢滴加溶于10 ml無水甲醇的2－羥基－1－萘甲醛(0.860 9 g，5 mmol)溶液，待原料滴加完畢，50 ℃反應3 h。回流過程中有大量白色絮狀沉淀析出［2，6，7］。反應結束后，趁熱過濾，濾餅分別用無水甲醇和無水乙醚洗滌3－4次，真空干燥得白色絮狀固體。產率:84%。

元素分析:C，58.70%;H，4.61%;N，17.08%;S，13.01%;ES－MS(CH3OH，m/z):246.0(［M+H］+);1H－NMR(500 MHz，DMSO－d6):11.42(s，1H，NHCS)，10.51(s，1H，OH)，9.06(s，1H，CH=N)，7.85 和8.25(2br s，1H each NH2)，8.53(d，1H，ArH)，7.89(d，1H，ArH)，7.86(d，1H，ArH)，7.57(t，1H，ArH)，7.38(t，1H，ArH)，7.21(d，1H，ArH)。13C－NMR(500 MHz，DMSO－d6):156.6 C(l)，143.03 C(k)，132.4 C(a)，131.0 C(i)，128.6 C(c)，128.0 C(d)，127.8 C(e)，123.4 C(g，h)，122.8 C(f)，118.3 C(b)，109.7C(j)。

2.1.2 水楊醛縮氨基硫脲(SATS)的合成與表征SATS的合成方法與HNTD類似，用水楊醛(521μl，5 mmol)替代2－羥基－1－萘甲醛。產率:56%。

元素分析:C，49.13%;H，4.69%;N，21.53%;S，16.39%。ES－MS(CH3OH，m/z):196.0(［M+H］+);1H－NMR(500 MHz，DMSO－d6):11.40(s，1H，NHCS)，9.89(s，1H，OH)，8.38(s，1H，CH=N)，7.92 和8.13(2br s，1H each NH2)，7.92(s，1H，ArH)，7.21(t，1H，ArH)，6.88(d，1H，ArH)，6.81(t，1H，ArH)。13C－NMR(500 MHz，DMSO－d6):177.6 C(h)，156.3 C(a)，139.5 C(g)，131.6 C(c)，126.7 C(e)，120.34 C(d)，119.2 C(f)，116.0 C(b)。

2.1.3 2－羥基－1－萘甲醛縮異煙肼(PAHN)的合成與表征 合成方法與HNTD類似，用異煙肼(0.685 g，5 mmol)替代硫代氨基脲。產率:52%。

元素分析:C，70.01%;H，4.61%;N，14.31%;O，11.07%。ES-MS(CH3OH，m/z):292.1(［M+H］+)。1H-NMR(500 MHz，DMSO－d6):12.52(s，1H，NHCO)，12.40(s，1H，OH)，9.48(s，1H，CH=N)，8.80(dd，2H，ArH)，8.31(d，1H，ArH)，7.97(d，1H，ArH)，7.88(br，3H，ArH)，7.62(t，1H，ArH)，7.41(t，1H，ArH)，7.26(d，1H，ArH).13C－NMR(500 MHz，DMSO－d6):108.5 C(j)，118.8 C(h)，120.9 C(b)，121.4 C(n，p)，123.6 C(f)，127.8 C(g)，127.9 C(e)，128.9 C(d)，131.6 C(c)，133.2 C(i)，139.8 C(m)，147.9 C(k)，150.4 C(o，q)，158.1 C(l)，161.0 C(a)。

2.1.4 水楊醛縮異煙肼(PAH)的合成與表征 合成方法與SATS類似。用異煙肼(0.685 g，5 mmol)替代硫代氨基脲。產率61%。

元素分析:C，64.13%;H，4.51%;N，17.33%;O，14.03%。ES-MS(CH3OH，m/z):242.0(［M+H］+)。1H-NMR(500 MHz，DMSO－d6):12.29(s，1H，NHCO)，11.07(s，1H，OH)，8.80(dd，2H，ArH)，8.68(s，1H，CH=N)，7.78(d，1H，ArH)，7.61(m，1H，ArH)，7.32(dd，2H Hz)，6.92(m，2H，ArH)。13C－NMR(500 MHz，DMSO－d6):116.4 C(b)，118.7 C(f)，119.4 C(d)，121.5 C(j，l)，129.2 C(e)，131.7 C(c)，139.9 C(i)，148.9 C(g)，150.4 C(k，m)，157.5 C(a)，161.3 C(h)。

4種化合物的紅外光譜數據見表1。

表1 4種化合物的紅外數據Table 1 The data of infrared spectrum of four Schiff bases

2.2 化合物與DNA作用的紫外－可見吸收光譜

參照文獻方法［4，5］，參比池中加入 2.5 ml Tris-HCl緩沖液，樣品池中加入等體積的含Schiff堿化合物(20μmol/L)溶液。逐漸滴加2μl DNA(0.024 mol/L)溶液于樣品池中，混勻約3 min后，在200－800 nm范圍內掃描化合物的紫外－可見吸收光譜。

參照文獻方法［8，9］，以 DMSO 為溶劑，分別觀測了四種Schiff堿與CT-DNA作用的紫外－可見吸收光譜變化情況見圖2和表2。

圖2 4種Schiff堿化合物與CT-DNA作用的紫外吸收光譜Figure 2 UV-Vis spectra of four Schiff bases upon increasing amounts of CT-DNA

表2 4種Schiff堿化合物與DNA作用的電子光譜在5 mmol/L Tris-HCl(p H=7.2)緩沖液中的變化Table 2 Changes of electronic spectra of 4 compounds in absence or presence of CT-DNA in 5 mmol/L Tris-HCl buffer(pH=7.2)

2.3 化合物體外抗腫瘤活性的研究

2.3.1 化合物的體外細胞毒性 用 MTT法［2，6］研究化合物的體外細胞毒性［2，8，9］。37 ℃ 下，往 96 孔細胞培養板中加靶細胞培養液，使0.1 ml含2×104的靶細胞，在CO2(5%)的飽和濕度的培養箱中培養，過夜后實驗組中分別加入4種化合物，使化合物的濃度為10－6－10－4mol/L，對照組中加入 0.1 ml培養基，實驗組和對照組于37℃，5%CO2的培養箱中培養，48 h后，吸去培養液，用PBS洗滌一次。每孔加20μl的MTT(5 mg/ml)染料溶液，繼續培養4 h后，將0.1 ml含有 DMF(50%，N，N－ 二甲基甲酰胺 )和十二烷基磺酸鈉(20%)溶液加入培養液中，用以溶解細胞中形成的甲臜，用酶標儀在560 nm處檢測各孔A值，每孔測試3次，求平均值。通過對數曲線法計算出50%細胞存活時化合物的濃度(IC50)。

2.3.3 四種Schiff堿化合物對不同腫瘤細胞的生長抑制作用 體外分別測試4種Schiff堿化合物對不同腫瘤細胞的生長抑制作用，結果見表3。從表3可以看出，4種Schiff堿化合物對3種腫瘤細胞的增殖都表現很好的抑制作用。

表3 4種化合物對腫瘤細胞的生長抑制作用的IC50值(μmol/L)Table 3 The IC50 values of 4 compounds against tumor cell lines (μmol/L)

3 討論

3.1 化合物的合成

四種新型Schiff堿的質譜峰測得值與理論值相一致。紅外光譜數據顯示(表1)，4種Schiff堿化合物都在3 450－3 167 cm－1出現氮氫(－NH－)振動峰，2 989－3 053 cm－1(C-H)和1 593－1 627 cm－1(－CH=N)處有明顯吸收，與文獻報道類似化合物的數據一致［6，8，9］。此外，在化合物的核磁共振氫譜中，四種Schiff堿化合物都在12.00－10.00區間出現了活潑氫峰(－OH，NHCO)，在7.0－9.0 之間出現了芳香氫峰，如化合物 HNTD，11.42處的單峰為－NHCS－ 的氫峰，10.51處為OH 活潑氫峰，9.06處為－CH=N－基團的氫峰，7.85和8.25處為末端氨基(NH2)的氫峰，同時，所有化合物的碳譜峰值與理論值相吻合［6－9］。上述紅外、核磁、質譜和元素分析數據表明所合成的化合物為目標化合物。

3.2 DNA 鍵合作用

由圖2可見，隨著小牛胸腺DNA的加入，4種化合物的紫外－可見吸收光譜發生了顯著紅移和減色效應。由表2可知，Schiff堿與CT-DNA鍵合后其減色率大小順序為SATS＞HNTD＞PAH＞PAHN。這可能與Schiff堿的剛性環結構和空間位阻有關，由于堿基對本身就是含有較多雜環并彼此配對，故剛性環較多和空間位阻較大的化合物可能不利于插入DNA堿基對。

通常，當小分子化合物與DNA相互作用后，其所處的環境發生改變，會導致其吸收波長與強度發生一系列變化。如果化合物以插入方式與DNA分子作用，那么化合物將與DNA堿基對發生π電子堆積作用并導致配合物電子吸光度的減小和波長的紅移。但是，當化合物以靜電或溝面結合與DNA分子結合時，化合物的電子吸收光譜變化不明顯［3－5］。多數研究者認為［1，3，5］，當化合物與 DNA 作用時，如π→π*躍遷峰明顯的減色和紅移，可被看作是化合物中插入DNA堿基對平面間的證據。因此，可推斷這四種Schiff堿與DNA發生插入式的鍵合作用。

3.3 腫瘤細胞生長抑制作用

從表3可以看出，四種Schiff堿化合物對腫瘤細胞的增殖都表現很好的抑制作用。化合物HNTD和SATS對SH-SY5Y和SK-N-SH腫瘤細胞的增殖較MCF-7細胞敏感并具有良好的抑制率。其中，HNTD對神經瘤細胞(SK-N-SH)抑制活性最好。此外以硫代氨基脲為前體的Schiff堿對神經瘤細胞抑制活性較好，以異煙肼前體的Schiff堿對乳腺癌細胞的抑制活性較好。值得注意的是，對于減色率相對較高的Schiff堿化合物SATS，其抗腫瘤活性明顯優于減色率較小的Schiff堿化合物，這與它們與DNA相互作用的大小順序一致。這一結果預示，這些Schiff堿化合物的抗腫瘤活性可能與它們和DNA的相互作用相關，其機制有待于進一步研究。

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