小鼠外周血免疫相關細胞的近日節律性研究

王慶敏，時粉周，唐 瑛，劉秋紅，戴圣龍，李科華

近日節律又名晝夜節律，是一種周期約為24 h的節律，是隨著白天和黑夜的交替而發生變化,在生命活動中起著重要的作用[1- 4]。機體的多種生理活動都被該種節律調控，如睡眠與覺醒、血壓、體溫、心跳及激素水平等。相關研究提示哺乳動物的免疫系統也存在近日節律現象,免疫系統近日節律紊亂可以導致多種疾病的發生[5]。因此,免疫系統是否存在近日節律性變化已日益引起人們的重視。已有相關實驗表明，免疫細胞系統的重要成分——單核細胞(來源于骨髓單系祖細胞)存在近日節律[6]。國內外雖然有小鼠相關免疫功能的近日節律研究報道,但其方法多為鏡下計數,主觀性較強,且報道的免疫細胞種類較單一，特別是一些淋巴細胞亞型的近日節律性目前尚不清楚。

本研究以C57 BL/6小鼠為研究對象，在12 h明∶12 h暗(12 h L∶12 h D)的光暗循環條件下,對其外周血中多種免疫細胞的晝夜波動性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 動物及模型建立 雄性C57 BL/6小鼠36只(體質量16～20 g)，4～6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，按數字表法隨機分為6組，每組6只。然后置于恒溫(22 ℃)、恒濕及12 h L∶12 h D(8∶00-20∶00光照,20∶00-8∶00黑暗)的光暗循環條件下適應性飼養4周，飼養期間小鼠自由攝食、飲水。光照期，鼠籠中央光強度為250 lx左右，黑暗期操作時紅光強度為10～15 lx。

1.2 試劑與材料 流式Anti-Mouse CD4 APC、Anti-Mouse CD8 PE為eBioscience公司產品，紅細胞裂解液為BD公司產品。小鼠外周血液成分用法國Hemastar 3全自動血液分析儀分析。

1.3 免疫細胞的檢測方法 小鼠在上述光照循環條件下飼養4周后，在9∶00、15∶00、21∶00、3∶00 4個時間點眼球取血，經Na2-EDTA抗凝處理后(1∶1),測定血液中各種免疫細胞數。測定的指標包括白細胞(WBC)、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞總數、CD4+淋巴細胞及CD8+淋巴細胞百分比。

1.4 流式分析CD4+、CD8+淋巴細胞百分比 小鼠外周血經Na2-EDTA抗凝處理后(1∶1)，經破紅處理,加入2 ml PBS洗滌、離心，沉淀用流式緩沖液重懸細胞。按說明書要求加入CD4+、CD8+熒光抗體，4 ℃避光孵育15 min,然后用2 ml流式緩沖液洗滌1次，上機檢測。

1.5 統計學處理 測定結果采用均數±標準差(x±s)表示，采用Student′st檢驗比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血WBC總數的近日節律性 見圖1。在1晝夜24 h里，WBC總數在15∶00最高,在21∶00最低，分別為(9.1±1.8)×109/L和(3.8±0.7)×109/L。峰值與谷值相比差異有統計學意義(P<0.01)。

注：與21∶00時比較aP<0.01

2.2 外周血淋巴細胞及其亞型(CD4+、CD8+)的近日節律性 如圖1所示,淋巴細胞總數15∶00達到高峰，為(8.57±1.21)×109/L；21∶00達到谷值，為(3.45±0.42)×109/L；峰值和谷值差異有統計學意義(P<0.01)。流式細胞技術檢測結果顯示,CD4+淋巴細胞的百分比21∶00時最高，15∶00時最低，峰值與谷值差異有統計學意義(P<0.01)；CD8+淋巴細胞的百分比21∶00時最高，9∶00時最低。峰值與谷值差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與15∶00時比較aP<0.01；與9∶00時比較bP<0.05

2.3 外周血中性粒細胞的近日節律性 在1晝夜24 h里，中性粒細胞數在3∶00達到峰值，為(0.127±0.009)×109/L；在9∶00達到谷值，為(0.081±0.007)×109/L。峰值和谷值差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.4 外周血單核細胞的近日節律性 在1晝夜24 h時間里，單核細胞數在15∶00達到峰值，為(0.487±0.031)×109/L；在21∶00達到谷值，為(0.247±0.017)×109/。峰值和谷值差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：與21∶00時比較aP<0.01；與9∶00時比較bP<0.05

3 討論

近日節律與機體的多種生理功能的變化關系密切,近日節律的破壞(如海上航行的倒班、值更)會導致人體產生多種不適、警覺性降低、情緒改變(如激越)、機體功能紊亂及疾病的發生。相關研究表明，近日節律的改變將增加患高血壓、心臟病、糖尿病及代謝性疾病、睡眠障礙和免疫功能紊亂的發生[7-8]。

船員長航、飛行員在特殊時間執行任務均可導致免疫功能近日節律的紊亂。長期輪換班、夜間工作以及長期工作于跨時區飛行航班上的女性乘務員因近日節律經常被打亂，乳腺癌的發病率較之對照組增高約48%[7]。流行病學資料提示[8]，夜間光照以及光照環境導致的晝夜節律紊亂會增加結腸癌的發生機會。目前已證實，免疫系統近日節律失調與腫瘤有關。在肝癌大鼠中發現,不但其免疫系統在構成上發生變化,免疫系統原有的近日節律也遭到破壞[9]。HIV感染患者T、B淋巴細胞的近日節律性逐漸喪失。另外，機體對傳染性疾病的易感性、疾病的發展進程(如風濕性關節炎、哮喘)等也存在近日節律性。這些都提示免疫系統近日節律的改變是這些疾病發生、發展的關鍵因素之一。有效防治這些與免疫功能近日節律紊亂相關的疾病的前提是要明晰正常狀態下各免疫細胞的近日節律性。

筆者系統研究了在12 h L∶12 h D光暗循環條件下小鼠外周血中各免疫細胞的近日節律性。先前也有相關文獻報道了小鼠外周血內免疫細胞的晝夜變化規律，但只選擇了幾個指標進行研究[10-11]，國內關于免疫細胞及功能的近日節律性研究較少，相關研究也不夠系統。本研究表明C57 BL/6小鼠外周血白細胞的趨勢與國外相關報道一致[12]。本研究進一步檢測了C57 BL/6小鼠外周血中的其他免疫成分,結果表明正常小鼠的外周血WBC計數、淋巴細胞百分比、單核細胞數、中性粒細胞數均存在著晝夜節律性。各類淋巴細胞的峰值均在15∶00-21∶00之間，單核細胞的百分比在15∶00達到高峰，中性粒細胞在3∶00達到高峰，說明小鼠外周血中各免疫細胞的峰值和谷值不在同一時間段,存在此消彼長的現象。這種方式可能有利于小鼠在不同時間段維持一定的免疫力。

綜上所述，本研究較系統地研究了C57BL/6小鼠外周血中各免疫細胞的近日節律性變化，不僅為深入理解免疫系統的機制提供依據，也為實驗動物學及免疫功能近日節律紊亂相關疾病的臨床治療打下基礎，為深入理解軍事人員(如長航艦員及跨時區飛行的飛行員)由于工作崗位的需要導致的免疫系統近日節紊亂提供理論依據。

[參考文獻]

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