豫醫卷毛大鼠表皮生長因子基因的比較生物學分析*

史崇敏，張明昊，朱奎成，杜春燕，王君敏，胡 濤，薛敬禮，章金濤#

1)鄭州大學實驗動物中心 鄭州 450052 2)河南中醫學院醫學機能實驗室 鄭州 450046

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一種小分子蛋白質，其生物學功能廣泛，在生物體生長發育過程中具有重要意義。首先它是一種廣譜促分裂劑，能促進細胞內DNA、RNA、蛋白質以及細胞外大分子的合成，并對多種組織來源的上皮細胞有很強的促分裂活性[1-3]；其次，EGF還能防止潰瘍發生、促進潰瘍愈合及調節精子的發育過程，并具有神經營養活性，參與神經前體細胞的增殖分化及生存、遷移。卷毛突變是一種被毛和胡須均發生彎曲的基因突變。國外[4-9]已報道了幾種這樣的突變類型，如wave-1、wave-2、cub、swh等。有些卷毛突變還具有一因多效性，伴發皮脂腺、乳腺、心臟和骨骼等發育異常，這些突變模型為研究毛發生長、組織分化、生長調節以及心臟等器官的疾病提供了較有價值的實驗材料[10]。豫醫卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)是2006年1月在SD大鼠種群中新發現的一種自發性突變動物，其卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制，呈半顯性遺傳[11]。作者克隆了YCHR EGF基因的cDNA序列，并與GenBank上發布的其他物種的EGF基因cDNA序列進行了同源性比較，旨在進一步探討哺乳動物EGF基因的同源性及其比較生物學特征。

1 材料與方法

1.1實驗動物8周齡YCHR 10只，雌雄各半，來自鄭州大學實驗動物中心，一級環境條件下飼養。

1.2EGFcDNA的擴增與測序①DNA的提取及處理：處死大鼠后立即取大鼠腦組織，用液氮速凍，并貯存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司SK1261)提取總DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。②引物設計及合成：參考GenBank上發表的大鼠EGF基因cDNA序列(GenBank登錄號：NM012842)，采用DNASTAR軟件設計22對重疊引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。③擴增與測序：取適量的DNA進行PCR擴增。PCR擴增產物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。

表1 EGF基因cDNA擴增所用引物

續表1

1.3EGFcDNA序列和氨基酸序列分析拼接YCHR EGF cDNA的完整序列，并從GenBank上下載相關物種(BN大鼠、家鼠、原雞、獼猴和人)EGF cDNA序列，采用DNAMAN軟件進行同源性比較與系統遺傳學分析。

2 結果

2.1YCHREGFcDNA的克隆PCR產物電泳后，均得到明顯特異性的目的條帶，產物大小與預期結果一致。將不同引物擴增的測序結果拼接獲得YCHR EGF基因的完整cDNA序列(GenBank登錄號：JX437943)，該序列全長為3 522 bp，編碼由1 061個氨基酸殘基組成的蛋白。

2.2EGF基因的比較生物學分析結果見表2、3。系統遺傳分析結果見圖1。EGF基因的系統進化樹顯示，YCHR與其他大鼠同在一個進化分支，大鼠與小鼠的親緣關系也比較近，與雞、猴、人的親緣關系較遠。

表2 YCHR與其他物種EGF基因編碼區核苷酸序列的同源性比較 %

1：大鼠(YCHR)；2：BN大鼠(NM012842)；3：家鼠(J00380)；4：原雞(AY588969)；5：獼猴(XM001088957)；6：人(X04571)。

表3 YCHR與其他物種EGF氨基酸序列的同源性比較 %

1：大鼠(YCHR)；2：BN大鼠(P07522)；3：家鼠(P01132)；4：原雞(AAT00452)；5：獼猴(XP001088957)；6：人(P01133)。

圖1 EGF基因的系統進化樹

3 討論

EGF基因在哺乳動物生長發育過程中扮演了重要的角色，它的突變可能會導致細胞增殖及機體生長發育的異常[12]。為了深入了解EGF基因組成的差異，作者克隆了YCHR EGF基因共計3 522 bp的cDNA序列，并對包括YCHR在內的5個物種的6條EGF基因的cDNA序列及其編碼產物的氨基酸序列的同源性進行了分析。作者發現，YCHR EGF基因同GenBank上發表的BN大鼠、家鼠、原雞、獼猴、人的同源性分別為97.8%、83.4%、59.7%、76.5%、73.5%，氨基酸序列的同源性分別為99.3%、79.9%、52.9%、69.6%、69.4%，表明該基因在進化過程中具有一定的保守性，但不同物種之間也存在特異性。就EGF基因及其編碼蛋白而言，人類與模式生物之間存在一定的序列與功能異同，因此可以利用這一特點，把其他物種來源的EGF基因作為人類EGF基因天然存在的“突變體”，進一步研究該基因的結構與功能特性。

綜上所述，該研究得到了YCHR EGF基因的cDNA序列，已經提交給GenBank，并通過不同物種EGF基因序列的同源性比較，初步了解了EGF基因在物種進化上的保守性與特異性，為下一步進行多態性檢測及其與YCHR某些性狀的相關性研究奠定了基礎。

[1] Chung I, Akita R, Vandlen R, et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells[J]. Nature, 2010, 464(7289)：783

[2] Jura N, Zhang X, Endres NF, et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms[J]. Mol Cell, 2011, 42(1): 9

[3] 王利群，徐冶，金仁順. EGFR及TGF-α在前列腺癌及前列腺上皮內瘤組織中的表達及其臨床意義[J]. 吉林大學學報：醫學版，2012，38(2)：308

[4] Beach RA, Wilkinson KA, Gumedze F, et al. Baseline sebum IL-1α is higher than expected in afro-textured hair: a risk factor for hair loss?[J]. J Cosmet Dermatol, 2012, 11(1): 9

[5] Sriwiriyanont P, Hachiya A, Pickens WL, et al. Effects of IGF-binding protein 5 in dysregulating the shape of human hair[J]. J Invest Dermatol, 2011, 131(2): 320

[6] Kuramoto T, Hirano R, Kuwamura M, et al. Identification of the rat Rex mutation as a 7-bp deletion at splicing acceptor site of the Krt71 Gene[J]. J Vet Med Sci, 2010, 72(7):909

[7] Shimomura Y, Wajid M, Petukhova L, et al. Autosomal-dominant woolly hair resulting from disruption of keratin 74 (KRT74), a potential determinant of human hair texture[J]. Am J Hum Genet, 2010, 86(4): 632

[8] Gandolfi B, Outerbridge CA, Beresford LG, et al. The naked truth: Sphynx and Devon Rex cat breed mutations in KRT71[J]. Mamm Genome, 2010, 21(9/10): 509

[9] Churko JM, Chan J, Shao Q, et al. The G60S connexin43 mutant regulates hair growth and hair fiber morphology in a mouse model of human oculodentodigital dysplasia[J]. J Invest Dermatol, 2011, 131(11): 2197

[10]Fujimoto A, Farooq M, Fujikawa H, et al. A missense mutation within the helix initiation motif of the keratin K71 gene underlies autosomal dominant woolly hair/hypotrichosis[J]. J Invest Dermatol, 2012, 132(10): 2342

[11]章金濤，張明昊，王純耀. 豫醫卷毛大鼠表皮生長因子受體基因的比較生物學分析[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2011，46(3)：351

[12]Tamama K, Kawasaki H, Wells A. Epidermal growth factor (EGF) treatment on multipotential stromal cells (MSCs). Possible enhancement of therapeutic potential of MSC[J]. J Biomed Biotechnol, 2010, 2010:795385