新型核苷類似物FNC對Raji細胞增殖、凋亡和Bcl-6、PRDM1、C-myc表達的影響*

張 艷，程旭芳，黃 剛，董靜靜，王陳萍，江金花，王慶端#，?？?

1)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院 鄭州450001 3)鄭州大學化學與分子工程學院 鄭州 450001

惡性淋巴瘤是一種起源于淋巴造血組織的實體瘤，臨床表現變化多端，特別是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)，易侵犯結外組織，給臨床診斷和治療帶來很大困難?；瘜W治療在侵襲性NHL的綜合治療中占主導地位，但傳統化療方案的治愈率較低[1]。目前，核苷類似物作為一類重要的抗腫瘤藥物，占據抗癌藥物市場近五分之一的份額[2]。核苷類藥物的化學結構與體內正常代謝物相似，可摻入到細胞的DNA與RNA中，抑制核酸的生成，干擾細胞的正常代謝。2’-脫氧-2’-氟-4’-疊氮-核苷類似物(FNC)由鄭州大學化學與分子工程學院合成，前期的研究[3]發現FNC可能對NHL有較好的治療作用。作者選用高侵襲性人Burkitt淋巴瘤Raji細胞作為研究對象，探討FNC對Raji細胞增殖的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器RPMI 1640培養液、DMSO和四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Solarbio公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Annexin-Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Trizol購于英俊公司；RT-PCR試劑盒購于寶生物公司；PCR引物由寶生物公司合成； Bcl-6、C-myc、β-actin抗體和山羊抗兔IgG均購于博奧森公司；PRDM1抗體購自Santa Cruz公司。Raji細胞購自中國科學院上海細胞庫，使用含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在飽和濕度、37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中常規培養。PCR擴增儀(Biometra公司)；凝膠成像分析系統和核酸蛋白分析儀(Eppendorf 公司)；DYY-6C型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)；酶聯免疫檢測儀、垂直電泳系統和電轉系統(Bio-Rad公司)；流式細胞儀(Beckman Coulter公司)；紫外透射分析儀(柯達公司)。

1.2細胞增殖情況的檢測采用MTT法。取對數生長期的細胞，調整細胞密度為9×107L-1，接種于96孔培養板中，100 μL/孔，實驗組分別加 0.035、0.350、3.500、35.000、350.000 μmol/L FNC，每個濃度均設5個復孔。同時設空白組(只加培養液)、陰性對照組(不加藥)。培養24、48和72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h。離心25 min，吸棄上清液，加入 DMSO 150 μL/孔，振蕩混勻后，用酶聯免疫檢測儀測570 nm波長下各孔的吸光度(A)值。實驗重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組平均A值/陰性對照組平均A值)×100%。

1.3細胞周期的檢測取對數生長期細胞，以1.5×109L-1的密度接種于6孔板中，分組處理，分別加入不同濃度的FNC或等體積培養液，使終濃度為0(對照)、0.035、0.175、0.875、4.375 μmol/L，培養48 h后收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心5 min，棄上清液。加入預冷的乙醇溶液固定，于4 ℃下過夜。用流式細胞儀分析，按Cell Quest軟件檢測并分析細胞周期分布。實驗重復3次。

1.4細胞凋亡的檢測實驗分組同1.3，培養48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌并離心，按 AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書操作，于1 h內上流式細胞儀，用Cell Quest軟件檢測并分析細胞凋亡和死亡的情況。結果判斷：FITC-/PI-為活細胞，FITC-/PI+為壞死細胞，FITC+/PI-為凋亡細胞， FITC+/PI+為凋亡后繼發死亡的細胞。實驗重復3次。細胞凋亡率=(凋亡細胞數+繼發死亡細胞數)/全部細胞數×100%。

1.5細胞中Bcl-6、PRDM1、C-mycmRNA的檢測

采用RT-PCR 法。實驗分組同1.3，培養48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，棄去上清，加入Trizol提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物設計見表1。PCR反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火(Bcl-6為52 ℃，PRDM1為56 ℃，C-myc為53 ℃)50 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃延伸7 min ，4 ℃保存。于30 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外透射分析儀觀察結果。實驗重復3次。采用Quantity one進行條帶光密度測定，以目的基因與β-actin 條帶光密度的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.6細胞中Bcl-6、PRDM1、C-myc蛋白的檢測采用Western blot法。實驗分組同1.3，培養48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，棄上清，提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白含量。取蛋白30 μg進行SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉移至NC膜上，用5 g/L脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗Bcl-6、抗PRDM1和抗C-myc多克隆抗體(均稀釋200倍)，4 ℃ 過夜。加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(稀釋1 000倍)，脫色搖床搖1 h，ECL顯影成像。實驗重復3次。用 Quantity one進行條帶光密度測定，以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0 進行分析，采用5×3析因設計的方差分析對細胞增殖抑制率進行分析，應用單因素方差分析對各組細胞周期、凋亡率和Bcl-6、PRDM1、C-myc mRNA及蛋白的相對表達量進行分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1FNC對Raji細胞增殖的影響見表2。

表2 FNC處理后Raji細胞增殖抑制率測定結果(n=3) %

F濃度=4 869.984，F時間=1 785.062，F交互=126.281，P均<0.001。

2.2FNC對Raji細胞周期及凋亡的影響見表3。

表3 FNC處理48 h后Raji細胞周期及凋亡率測定結果(n=3) %

*：兩兩比較，P均<0.05。

2.3FNC對Raji細胞Bcl-6、PRDM1、C-mycmRNA和蛋白表達的影響RT-PCR和Western blot結果見圖1、2，FNC處理48 h后Raji細胞Bcl-6、PRDM1及C-myc mRNA與蛋白表達的分析結果見表4。

圖1 Bcl-6、PRDM及C-myc mRNA測定結果

表4 FNC處理48 h后Raji細胞Bcl-6、PRDM1及C-myc mRNA與蛋白的表達(n=3)

*：兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

作者通過MTT法檢測顯示，FNC對人Burkitt淋巴瘤Raji細胞的增殖具有明顯的抑制作用，呈劑量、時間依賴性。

近年研究[4]發現，細胞周期調控異常和細胞凋亡在腫瘤的發生發展中起重要作用。細胞增殖是通過細胞周期的運轉來實現的。該研究結果顯示，隨著FNC濃度的增加，G0/G1期細胞增多，提示FNC抑制細胞的增殖可能與其阻滯細胞從G0/G1期向S期的轉變有關，使細胞不能進入S期進行DNA的合成，最終導致增殖抑制，該作用呈明顯的劑量-效應關系，提示誘導凋亡可能是FNC抗腫瘤作用的機制之一。

Bcl-6是一個含有鋅指結構的轉錄抑制因子，是原癌基因，在很多類型的淋巴瘤中都能檢測到Bcl-6基因的異常高表達。Bcl-6可以通過抑制p27及CCND2的表達，促進淋巴瘤細胞增殖；通過抑制PDCD2基因及P53基因，抑制淋巴瘤細胞凋亡[5-6]。Bcl-6可通過抑制PRDM1表達，抑制B細胞分化為成熟的漿細胞，從而導致淋巴瘤的發生[7]。PRDM1是一個含有5個鋅指結構的轉錄抑制因子，是抑癌基因，又名B淋巴細胞誘導成熟蛋白，是參與B細胞和T細胞終末分化的關鍵調控因子[8-9]，PRDM1功能的異常可導致B細胞不能分化為漿細胞而最終導致腫瘤的發生。研究[10]顯示PRDM1有α與β轉錄本，可能是2個轉錄本的表達及比例異常導致了腫瘤的發生。C-myc是PRDM1直接抑制的下游基因[11]，是一個原癌基因。C-myc是Burkitt淋巴瘤的遺傳學標志[12]，其功能是改變細胞周期、凋亡，促進細胞增殖及抑制細胞分化而引起淋巴瘤的發生[13]。C-myc 基因的異常表達是癌變過程中較早出現的分子改變，活化的C-myc 可以作為原癌基因參與腫瘤的形成及發展[14]。C-myc也可通過抑制其下游基因，而對細胞的凋亡和細胞周期產生影響[15]。該研究結果顯示，在FNC作用下，Raji細胞中Bcl-6的表達降低，PRDM1的表達升高，從而導致C-myc的表達降低，從而產生抗腫瘤作用。

綜上所述，FNC可下調Bcl-6、C-myc的表達，上調PRDM1的表達，從而抑制Raji細胞的增殖，誘導細胞凋亡。這可能是FNC抗腫瘤作用的重要機制。

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