和厚樸酚對小鼠四氯化碳肝損傷的保護作用*

劉長海，華春秀，歸改霞，劉錦輝，李賀文，夏西超#

1)南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院檢驗科 南陽 473058 2)南陽醫學高等專科學校基礎醫學院 南陽 473061

中藥厚樸具有消除胸腹滿悶、止痛、健胃、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用[1-2]。和厚樸酚(honokiol，HNK)是中藥厚樸的主要化學成分，屬于聯苯酚類化合物[3-4]。現代醫學研究發現，HNK具有抗炎[5]、降低膽固醇[6]、抗衰老[7]、誘導凋亡[8]等多種藥理作用，但關于HNK在肝損傷中的保護作用未見報道。四氯化碳(CCl4)能通過脂質過氧化引起肝細胞壞死[9]、脂變性及反應性增生[10]，CCl4肝損傷模型常用作篩選具有保肝和治療肝病作用的藥物模型[11]。作者擬在CCl4誘導的小鼠肝損傷模型基礎上探討HNK對肝損傷是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1動物來源及分組昆明種小鼠50只(購自武漢大學，清潔級)，雌雄各半，體質量(20±2) g。采用隨機數字表法將小鼠分為HNK (購自阿拉丁試劑有限公司)高、中、低劑量組(分別以20.0、2.0、0.2 mg/kg劑量皮下注射HNK注射液)，正常組和模型組(2組注射等量生理鹽水)5組，每組10只，均給藥1次/d，連續6 d，記錄給藥期間小鼠的攝食量和飲水量。第7天給藥2 h后，模型組和HNK高、中、低劑量組小鼠腹腔注射含體積分數0.25% CCl4的大豆油溶液(10 mL/kg)，正常組注射等體積大豆油溶液，禁食，自由飲水，24 h后摘除眼球取血，制備血清；解剖肝臟，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2肝臟病理學觀察采用HE染色方法觀察大鼠肝臟病理學變化，即肝臟組織的一般形態結構、肝小葉及間質有無異常。

1.3肝功能指標檢測采用日本奧林巴斯AU2700型自動生化分析儀測定各組小鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和血糖(Glu)的含量。相關試劑購自上海榮盛生物技術有限公司。

1.4血清中ALT、AST、ALPmRNA以及肝臟組織中TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA的檢測用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取小鼠血清及肝臟組織總RNA，檢測證實總RNA的完整性和純度均符合實驗要求。由上海生工生物工程有限公司設計并合成各目的基因和內參基因β-actin引物(表1)。按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)操作說明合成cDNA。反應體系：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μL，總RNA 100 ng。反應條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。使用ABI7500型 real-time PCR儀進行擴增，實時熒光定量PCR體系(20 μL)：SYRB Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye(TaKaRa)0.4 μL，dH2O 6.8 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 40個循環。結果采用2-ΔΔct進行分析。

1.5統計學處理采用SPSS 10.0進行分析，應用單因素方差分析比較各組小鼠血清中ALT、AST、ALP含量及mRNA水平和Glu濃度、肝臟組織中TNF-α、IL-6 和IFN-γ mRNA表達的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

表1 引物及序列

2 結果

2.1各組小鼠肝組織病理學變化正常組大鼠肝組織結構完整；細胞核呈紫藍色，細胞質呈粉紅色，肝細胞呈索狀結構排列，分界清晰，大小較均一，核圓而清晰，位于細胞中央，未見脂肪變性和炎性細胞浸潤(圖1A)。模型組肝細胞失去正常的索狀結構，肝索排列紊亂，細胞索之間纖維細胞增生，中央靜脈變形；肝細胞腫脹并呈泡狀脂肪變性，胞質內充滿大小不等的圓形脂滴；小葉內點、灶狀肝細胞壞死，伴淋巴細胞和中性粒細胞浸潤(圖1B)。HNK各劑量組上述變化均有不同程度減輕，尤以HNK高劑量組變化最明顯(圖1E)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學變化(HE,×400)

2.2各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和Glu比較見表2。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和Glu比較(n=10)

*：與正常組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。

2.3各組小鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA表達的比較見表3。

表3 各組小鼠肝臟組織中

*：與正常組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。

3 討論

肝損傷是由多因素參與的復雜病理過程，在此過程中，多種酶的表達發生重大變化，其中ALT、AST和ALP是用來衡量肝損傷與否及程度的常用指標[12-13]。

該研究發現，CCl4處理后，模型組小鼠肝臟和血清中ALT、AST和ALP表達量高于正常組，提示肝損傷造模成功。ALT、AST和ALP均為可溶性酶，肝臟中這些酶主要存在細胞質內，當肝細胞受到破壞，細胞通透性增加，這些酶迅速釋放，血清中ALT、AST和ALP的含量隨之升高[14]。由此，這些酶表達水平的高低能直接反映肝細胞損傷與否及損傷程度。病理學變化顯示，與模型組相比，HNK高、中、低劑量組肝細胞損傷減輕；同時血清ALT、AST和ALP的表達水平均有不同程度降低，其中以高劑量組變化最明顯，提示HNK能提高肝細胞膜結構穩定性，增強肝細胞抗損傷能力，對肝損傷有一定的保護作用，且以高劑量組效果較好。

HNK處理后，肝臟中ALT、AST和ALP的轉錄水平下調和血清中對應的酶活性水平降低有不一致現象，提示這些酶在肝臟中從轉錄下調到血液對應酶活性的降低有一個復雜的加工過程，如基因轉錄后的調控和翻譯水平的調控。該研究結果顯示，HNK對ALT、AST和ALP表達下調強度也不一樣，提示一方面可能與HNK調控路徑有關；另一方面，可能與靶基因對HNK具有劑量依賴性。該研究中的形態學變化間接反映了該現象。

肝臟的損傷和保護與其他組織相似，由促炎因子和抗炎因子的共同調控來完成。在促炎因子的表達受到抑制，抗炎因子發揮主導作用的情況下，有助于損傷的修復，增強機體的保護作用[10,15-16]。HNK處理后可抑制急性肝損傷模型中促炎關鍵因子TNF-α、IL-6 和IFN-γ表達，實現了對小鼠肝臟的保護作用。還有研究[17-18]報道，促進糖元合成，減少糖異生是預防和治療肝損傷的重要措施。作者的研究結果顯示，HNK還具有降低血糖的作用，尤其是高劑量組，提示HNK對肝臟保護作用是一個多因素參與的復雜過程，其具體的作用機制有待更深入的探究。

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