攜帶人IL-10基因的腺病毒載體的構建及其對大鼠肝細胞損傷的保護作用*

程 劍，沈曉潔，劉 艷

無錫衛生高等職業技術學校病理學教研室 無錫 214028

白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一種抗炎癥反應的細胞因子。研究[1]表明，IL-10可以抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、趨化因子和細胞間黏附分子mRNA的表達，從而減輕大鼠的肝損傷。Donckier等[2]發現對豬的肝臟給予IL-10的預治療，可以降低受體的轉氨酶以及減少肝臟的炎性細胞浸潤和細胞壞死，減輕肝臟的損傷。另外，T細胞在肝損傷中扮演著重要的角色，IL-10在肝損傷時不僅抑制枯否細胞釋放細胞因子，還抑制T細胞功能[3]。因此，IL-10具有保護肝細胞的功能，在肝臟外科和器官移植領域中有很大的應用潛力。作者構建了攜帶人IL-10(hIL-10)基因的非增殖型重組腺病毒載體，體外細胞學實驗驗證其對大鼠肝細胞損傷的保護作用，為IL-10基因治療在肝臟外科和肝臟移植領域中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1攜帶hIL-10基因的重組腺病毒載體的構建合成hIL-10引物(上游：5’-CCGGAATTCACCATG GCCCACAGCTCAGC-3’，含EcoRⅠ酶切位點；下游：5’-CGACGTCGACTTATCAGTTTCGTATCTTCATTGTC -3’， 含SalⅠ酶切位點，擴增產物大小552 bp)和EGFP引物(上游：5’-GGAAGATCTACCATGGTGAG CAAGGGC-3’, 含BglⅡ酶切位點；下游：5’-TG CACTCGAGTTATTATCTAGATCCGGTGGATC-3’，含XhoⅠ酶切位點，擴增產物大小760 bp)。以pORF-hIL-10質粒(美國Invivo Gen公司產品)為模板，用hIL-10引物PCR擴增hIL-10 cDNA序列。反應參數：96 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共20個循環；再72 ℃延伸10 min。擴增產物用80 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 用膠回收試劑盒回收大小為552 bp的DNA片段。將該片段克隆入pUC19載體中，測序鑒定。將pUC19-hIL-10酶切，回收hIL-10 cDNA片段，克隆入pDC315載體，構建pDC315-hIL-10。同樣方法構建對照腺病毒載體pDC315-EGFP。

將質粒pDC315-hIL-10、pDC315-EGFP分別與5型腺病毒骨架質粒pBGHE3通過Lipofectamine2000共轉染293細胞，進行細胞內同源重組。2周后各挑取病毒噬斑2個，應用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，經PCR鑒定重組腺病毒DNA中是否克隆了hIL-10、EGFP基因。鑒定正確后，命名為Ad5-hIL-10和Ad5-EGFP。病毒在293細胞中反復擴增，氯化銫梯度離心法純化。

1.2大鼠肝細胞的分離與培養清潔級的雄性SD大鼠，體質量250～300 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供。采用二步膠原酶灌注法分離大鼠肝細胞[4]，懸浮于RPMI 1640培養基中，在37 ℃、體積分數5% CO2條件下繼續培養。

1.3腺病毒載體感染效率的測定大鼠肝細胞鋪96孔板，1×103孔-1，培養24 h，換用無血清培養液，加入感染強度(MOI)=1、5、10、50的Ad5-EGFP，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分數2%血清培養液培養48 h后，熒光顯微鏡下觀察，在熒光顯微鏡暗視野及明視野交替切換，選擇3個200倍視野，計數綠色熒光陽性細胞，并計算陽性細胞占總細胞的比例。實驗重復3次。

1.4Ad5-hIL-10基因表達的測定大鼠肝細胞鋪96孔板，5×104孔-1，培養24 h，換用無血清培養液，加入MOI分別為1、5、10、50的Ad5-hIL-10，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分數2%血清培養液，培養48 h。收集培養細胞上清，采用hIL-10 ELISA試劑盒(Invitrogen公司產品)測定hIL-10含量，實驗重復3次，方法參考試劑盒說明。

1.5Ad5-hIL-10對CCl4誘導的肝細胞損傷的保護作用大鼠肝細胞鋪96孔板，5×104孔-1，培養24 h后，分組處理，每組設8個復孔。A組為實驗組：細胞貼壁后，換用無血清培養液，加入MOI分別為1、5、10、50的Ad5-hIL-10，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分數2%血清培養液，培養24 h后，加入CCl4(北京化工廠產品)至終濃度0.5 mol/L，繼續培養24 h。B組為損傷對照組：細胞感染Ad5-EGFP，與A組同步加入相同濃度的CCl4。C組為空白對照組：細胞同步培養，不加病毒和CCl4。采用MTT法檢測細胞存活率。

1.6統計學處理采用SPSS 13.0進行分析。不同MOI預處理大鼠肝細胞中綠色熒光陽性細胞比例、hIL-10含量及3組肝細胞存活率的比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1重組腺病毒的鑒定病毒噬斑經PCR均擴增出hIL-10或EGFP基因(圖1)。

2.2Ad5-EGFP對大鼠肝細胞的感染效率隨著MOI的升高，病毒感染效率也逐漸增高，差異有統計學意義(F=25.571,P<0.001)。見表1、圖2。

表1 大鼠肝細胞中

*:與MOI=1相比，P<0.01；#：與MOI=5相比，P<0.01；△：與MOI=10相比，P<0.01。

2.3Ad5-hIL-10基因的表達大鼠肝細胞上清中hIL-10含量見表1。隨著MOI的升高，hIL-10含量上升，差異有統計學意義(F=52.667，P<0.001)。

圖1 重組腺病毒Ad5-hIL-10(上)和Ad5-EGFP(下)的PCR鑒定結果

圖2 腺病毒Ad5-EGFP感染大鼠肝細胞的效率(×200)

2.4hIL-10表達對CCl4誘導的大鼠肝細胞損傷的保護作用見表2。

表2 各組大鼠肝細胞存活率的比較

*:與B組比較，P<0.05；#:與C組比較，P<0.05。

3 討論

肝炎、肝炎后肝硬化以及肝臟外科手術、肝移植都存在肝細胞的損傷，如何減輕肝細胞損傷、保護肝功能成為肝臟病治療中需要面對的問題。通過基因治療手段來預防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。

IL-10是一種多效應的細胞因子，它的主要功能就是限制和終止炎癥反應[5]。IL-10由Th2分泌, 能抑制Th1型細胞因子的分泌，對細胞免疫和體液免疫及炎癥過程均有廣泛影響[6-7]。hIL-10與鼠IL-10蛋白有73%的同源性，hIL-10蛋白可作用于鼠細胞，而鼠IL-10蛋白對人細胞并不起作用。hIL-10 主要由單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞分泌，Th1和Th2受刺激后均可分泌，肝內枯否細胞也可分泌。近年來的研究證實，IL-10是一個多效性細胞因子, 具有廣泛的生物學作用：可以抑制T 淋巴細胞，主要參與T淋巴細胞免疫調節，抑制T 淋巴細胞激活，誘導T淋巴細胞免疫耐受，抑制抗體依賴性T 淋巴細胞的增殖[8]；刺激B 淋巴細胞，促進B淋巴細胞激活及其抗體分泌[9]；抑制單核巨噬細胞的激活及其細胞因子的分泌[10]；抑制前炎性細胞因子分泌。總之，IL-10 是一種生物學作用廣泛的細胞因子，IL-10 的肝細胞保護作用是一個重要方面。IL-10 可通過抑制前炎性細胞因子的分泌、抑制中性粒細胞的激活與其黏附分子的表達等機制，來抑制肝損傷時的急性期增殖反應和肝纖維化的發生。

作者以腺病毒為載體成功構建了攜帶hIL-10基因的Ad5-hIL-10，該腺病毒載體可以高效率體外感染大鼠肝細胞并表達其攜帶的外源基因hIL-10，為外源基因行使生物功能奠定了良好的基礎。在此基礎上，作者建立CCl4誘導的肝細胞損傷模型，采用Ad5-hIL-10進行預防性干預，發現可以有效預防肝細胞損傷，提高肝細胞在損傷誘導劑存在情況下的存活率。該攜帶hIL-10基因的腺病毒載體在肝病領域中將有很大的應用潛力。

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