BEZ235對A549細胞增殖及akt、mek、erk mRNA表達的影響

張 芳，韓 娜，蔡 晶，方 黎，張中冕

鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

肺癌是目前全球范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤。中國非小細胞肺癌患者占肺癌總數的75%～80%，多數患者在確診時已處于晚期，失去手術治療的機會；接受根治性手術的患者也多數因復發及遠處轉移而導致治療失敗，藥物治療仍是晚期非小細胞肺癌治療的重要手段之一[1-4]。新型藥物BEZ235是磷酸肌醇3(PI3K)和其下游因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的雙重靶向抑制劑，已表現出良好的抑制多種實體瘤的作用[5-8]。該研究以人肺腺癌A549細胞為研究對象，觀察BEZ235對A549細胞增殖及akt、mek、erk mRNA表達水平的影響, 初步探討BEZ235在肺癌治療中的作用，為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料BEZ235購自上海翊圣生物科技有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所，RPMI 1640培養液和2.5 g/L胰蛋白酶購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)和MTT購自Sigma公司。A549細胞株由鄭州大學第二附屬醫院中心實驗室提供。akt、mek和erk擴增引物序列和擴增產物長度見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2細胞培養與分組A549細胞用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液(內含青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L)，置于體積分數5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養。每1～2 d 傳代1 次，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為4組，對照組(僅含細胞和培養液而不含藥物)，BEZ235低、中、高劑量組(分別加入2.5、5和10 mol/L BEZ235)，培養24、48、72 h。

表1 akt、mek和erk擴增引物序列和擴增產物長度

1.3細胞增殖抑制率檢測取對數生長期的A549細胞，經胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，細胞密度約為5 000個/孔，置恒溫培養箱中孵育12 h后吸出原培養液，按照1.2中分組處理，每組設6個復孔。實驗中止前4 h，每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT培養4 h 后，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min。以空白對照孔調零，在492 nm 波長處用自動酶標儀測定每孔的吸光度(A)值。細胞增殖抑制率 = (1-A實驗/A陰性對照)×100%。

1.4akt、mek、erkmRNA的檢測采用RT-PCR。取對數生長期的A549細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成細胞懸液，以1×105mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，常規培養，12 h后完全貼壁，按照1.2中分組，作用48 h后終止。細胞經PBS洗滌后, 每孔加入1 mL Trizol，提取總RNA，逆轉錄為cDNA。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共33個循環；最后72 ℃延伸15 min。擴增產物經1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳(120 V，18 min) 后，紫外透射儀下觀察并照相，以目的基因與內參條帶亮度的比值代表mRNA的相對表達量，實驗重復3次。

1.5統計學處理采用 SPSS 17.0處理數據。采用3×3析因設計的方差分析比較不同濃度BEZ235作用不同時間對A549細胞增殖抑制率的影響；采用單因素方差分析比較不同濃度BEZ235作用于A549細胞48 h后akt、 mek及erk mRNA表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1BEZ235對A549細胞增殖的影響隨著BEZ235作用濃度的升高及作用時間的延長，A549細胞的增殖抑制率升高，呈濃度、時間依賴性。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較(n=6) %

F組間=233.315，F時間=171.598,F交互=6.770，P均<0.001。

2.2BEZ235對A549細胞akt、mek、erkmRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，各組均可檢測到akt、mek、erk mRNA的表達，見圖1。

圖1 不同濃度BEZ235作用48 h后A549細胞akt、mek、erk mRNA的表達

隨著BEZ235濃度的增高，akt mRNA的表達水平下降，而mek、erk mRNA的表達水平無明顯改變，見表3。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK是兩條重要的信號轉導通路，在腫瘤細胞的生長、增殖、遷移和凋亡中起關鍵作用，這兩條通路是抗腫瘤藥物治療的有效靶點，且PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信號通路間可能存在特異信號交流[9-11]，Akt 通過使Raf 磷酸化可有效抑制Raf 的活性，如果使用抑制劑抑制Akt的活性，則Raf/MEK/ERK通路的活性增強[12]。新型藥物BEZ235是PI3K和mTOR雙激酶抑制劑，可競爭性結合酶的ATP結合槽，目前已進入Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗。Xu 等[13]的研究表明BEZ235對于雷帕霉素耐藥的細胞具有很好的抑制作用；Engelman等[14]的研究表明BEZ235對存在k-ras突變的肺癌小鼠的抑瘤效果并不佳，當聯合MEK抑制劑時抑瘤效果明顯好于單用BEZ235，二者聯合有顯著的協同抑瘤作用。

為了探討BEZ235作為PI3K/mTOR的雙重抑制劑在發揮其抑瘤作用時是否會對Raf/MEK/ERK通路產生影響，該研究以肺癌A549細胞為研究對象，通過MTT檢測不同濃度BEZ235處理后對細胞增殖的抑制作用，同時選擇在腫瘤發生、發展中起重要作用的PI3K/Akt/mTOR與Raf/MEK/ERK兩條通路上的關鍵分子akt、mek和erk, 通過RT-PCR檢測相關mRNA表達水平的變化。結果表明，BEZ235能夠抑制A549細胞增殖，且抑制作用呈濃度和時間依賴性；RT-PCR結果顯示BEZ235可降低A549細胞akt mRNA的表達水平，但對mek、erk mRNA的表達水平無明顯影響。

總之，該研究結果顯示，BEZ235能夠呈濃度和時間依賴性抑制A549細胞增殖，這種抑制作用可能與下調akt mRNA的表達有關。BEZ235在肺癌中的作用有待進一步深入研究，從而為聯合用藥及臨床治療提供實驗基礎。

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