哮喘患兒外周血髓系抑制細胞、IL-10和IL-12水平檢測*

張艷麗，王秀芳，喬俊英，雷瑞瑞，宋 麗，劉 瑩

鄭州大學第三附屬醫院兒內科 鄭州 450052

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，嚴重危害兒童的身心健康。其發病機制尚不十分清楚，但細胞因子在該病中的作用已受到國內外學者越來越多的關注。近年來，白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)和白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)作為Th細胞分泌的重要細胞因子，在哮喘發病中的作用越來越受到重視[1]。另外，國外對哮喘動物模型的研究[2]表明免疫細胞與哮喘相關，但機制不明。髓系抑制細胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)是起源于骨髓、CD11b+CD33+的抑制性細胞，在重癥感染、腫瘤、急慢性炎癥等患者中明顯增多，并且負向調節機體的免疫功能[3-4]。關于MDSCs與兒童哮喘之間的關系國內外尚無報道。該研究通過檢測哮喘患兒外周血MDSCs和血清IL-10及IL-12的水平，探討它們在兒童哮喘發病中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2011年1月至2012年4月在鄭州大學第三附屬醫院兒內科門診就診或住院治療的急性發作期哮喘患兒52例為哮喘發作組，其中男28例，女24例，年齡1.9～4.9(3.1±1.1)歲；選擇同期的哮喘緩解期患兒50例為哮喘緩解組，其中男26例，女24例，年齡1.8～4.7(2.9±0.9)歲；診斷均參照《全球哮喘防治創議》中的哮喘診斷標準[5]。選擇同期在該院兒童保健部健康體檢兒童48例為正常對照組, 其中男26例，女22例，年齡2.2～5.0(2.9±0.9)歲；45例同期在該院兒內科住院的肺炎患兒為肺炎對照組，其中男24例，女21例，年齡1.9～4.9(2.8±0.8)歲。均獲得入選患兒家長書面知情同意，并征得醫院醫學倫理委員會的同意。

1.2外周血MDSCs的檢測取抗凝血30 μL，加入上機管中，避光條件下分別加入CD11b+、CD33+標記的抗體各3 μL，振蕩，混勻，管底部插入冰中避光孵育20 min，然后取出，加入紅細胞裂解液1 mL，振蕩后避光裂解15 min，離心，棄上清，加入PBS液1 mL，振蕩，混勻，再離心，棄上清，加入PBS液1 mL，振蕩，混勻，再離心，棄上清，加入40 g/L多聚甲醛300 μL，振蕩，混勻，4 ℃冰箱保存，1周內上流式細胞儀檢測。采用兩色熒光標記技術流式細胞儀進行測定，分析采用CELLQuest軟件，用FSC/SSC設門，畫出有核細胞群(R1)，以去除死細胞及細胞碎片，二維點圖顯示R1內細胞，右上顯示CD11b+/CD33+二維點圖。結果以MDSCs占單個核細胞的比例表示。

1.3血清IL-10、IL-12的檢測受試者于就診第1天或入院第1天空腹采集股靜脈血3 mL，立即置于不加任何抗凝劑的干燥試管內，于水浴箱37 ℃水浴1 h后，3 000 r/min離心10 min，迅速、小心地分離出血清置于無菌EP管內，放置-70 ℃冰箱保存，以待檢測血清IL-10、IL-12水平。 IL-10、IL-12的測定采用雙抗體夾心ELISA法(ELISA試劑盒購自美國R & D公司)，操作嚴格按照說明書的步驟進行。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行分析。各組間MDSCs、IL-10及IL-12水平的比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q檢驗；哮喘發作組MDSCs與IL-10、IL-12的關系應用Pearson積差相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組兒童外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比較結果見表1。

表1 各組外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比較

*：與其他3組比較，P均<0.05。

2.2哮喘發作組患兒外周血MDSCs與IL-10、IL-10的相關性相關分析結果顯示，哮喘發作組患兒外周血MDSCs與IL-10呈正相關(r=0.741，P=0.007)，與IL-12呈負相關(r=-0.879，P=0.014)。

3 討論

TH1/TH2 平衡理論作為過敏性疾病如支氣管哮喘發病機制中的核心已為大多數人所接受。IL-12是最重要的Th1型細胞因子之一，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，在機體抗感染免疫及炎癥過程中起著重要的調節作用[2]。IL-10主要是由單核巨噬細胞產生的一種具有多面性生物活性的強免疫抑制因子，它可以抑制多種細胞合成相關細胞因子，改變機體的免疫應答和MHCⅡ類抗原的表達。IL-10在哮喘中的作用存在爭議。MDSCs可負向調節機體的免疫功能[3]，它可誘導調節性T細胞(Tregs)間接影響T細胞的激活，Tregs可以下調細胞介導的免疫反應。基于上述機制，作者推測MDSCs在患兒哮喘過程中也起到重要的作用。

國外學者Grissell等[6]研究表明病毒感染誘發的哮喘，IL-10呈高表達狀態。該結果顯示，哮喘發作組較其他3組血清IL-10水平顯著升高，與上述報道相一致。

IL-12在哮喘發病中起重要作用，并且其基因多態性與哮喘發病的危險指數相關[7]。周洋等[8]研究發現動態測定IL-12水平是判斷支氣管哮喘病情變化的有益指標，這與該研究發現的哮喘發作組與其他3組相比，血清IL-12水平顯著降低相一致。

Poe等[9]研究表明患細菌性肺炎的小鼠中MDSCs樣細胞和肺IL-10水平增加，這與該研究中肺炎對照組外周血MDSCs水平、血清IL-10水平無明顯增加相反，推測可能與該研究對象為人相關。Kosaka等[10]研究表明細胞因子IL-10在MDSCs的產生和調節方面起重要作用；國外學者Kao等[11]發現MDSCs通過下調巨噬細胞分泌的IL-12水平發揮抑制作用，Bunt等[12]研究顯示劇烈炎癥可誘導MDSC產生高水平的IL-10，其誘導巨噬細胞分泌IL-12的減少依賴于MDSCs產生較多的IL-10。這與該研究發現MDSCs與IL-10呈正相關，與IL-12呈負相關相一致。因此推測MDSCs和巨噬細胞的相互作用引起IL-10的顯著升高和IL-12的降低促進了哮喘慢性炎癥的發展。MDSCs可能成為哮喘治療的新靶點，至于MDSCs在哮喘發病過程中更確切的機制及治療應用尚待進一步研究。

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