5-羥色胺在覺醒肽（Orexin-A）促醒酒精性昏迷大鼠中的作用

解放軍第309醫院急救部（北京100091） 王天昊 樊雙義 閆 潔 陳 遠 馬朋林

由于對覺醒系統認識的不充分，昏迷的促醒研究也無重大進展。1998年覺醒肽（Orexins）的發現使人們對睡眠、覺醒的認識進入新的階段，也為昏迷的治療提供廣闊的前景。研究發現［1-2］分泌Orexins的神經元僅位于下丘腦外側區（LHA），但其神經纖維卻可投射到網狀上行激動系統的廣泛區域，如5-羥色胺能的中背縫核（DR）、組胺能的乳頭體核（TMN）、去甲腎上腺素能的藍斑（LC）等，因此，Sakurai等［3］推測 Orexins可能作用于5-羥色胺能等神經系統，促進5-羥色胺、組胺、去甲腎上腺素的釋放從而促進睡眠的覺醒并實驗證實。Orexins可促進睡眠覺醒，但是否可促醒昏迷。酒精性昏迷是臨床上常見的昏迷類型，賈曉軍［4］的前期研究證實，腦室注射Orexin-A可對酒精性昏迷起到促醒作用。然而，其促醒機制是否與5-羥色胺素能等神經系統的激活相關尚無定論。本實驗擬通過向酒精性昏迷大鼠模型腦室內注入特異性5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑，以翻正反射持續時間（LORR）和大鼠皮層腦電δ波為評價指標，探討Orexin-A對酒精性昏迷促醒作用是否與5-羥色胺系統相關。

材料和方法

1 實驗動物及分組 本研究選取健康成年雌性SD大鼠24只（由第三軍醫大學實驗動物中心提供），平均體重200±30g。按隨機數排序分組法，將大鼠分為對照組（人工腦脊液，ACSF）、覺醒肽組（Orexin-A）、阻斷劑組（5-羥色胺受體阻斷劑利坦色林，Ritanserin）及阻斷劑+覺醒肽組（Ritanserin+Orexin-A）4組。

2 主要溶液的配置 人工腦脊液（ACSF）的配制：ACSF中各種離子成份及其濃度（mM）：NaCl 126，KCl 2.5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.25，NaHCO326，葡萄糖10。Orexin-A溶液的配制：用ACSF溶解配制成 Orexin-A溶液：4nmol／5μl、4nmol／10μl。配制劑量參考以往文獻［5-6］。32%酒精溶液的配制：取無水乙醇以生理鹽水稀釋配制成32%的酒精溶液。Ritanserin溶液的配制：用新鮮ACSF配制，所配濃度分別為：Ritanserin40μg／5μl、40μg／10μl。

3 酒精昏迷模型建立及意識狀態分級 參照Yacoubi、賈曉軍等建立酒精性昏迷模型［4，7］。腹腔注射32%酒精溶液（14ml／kg），將大鼠的意識狀態分為6級：Ⅰ級：在籠內活動如常；Ⅱ級：在籠內活動減少；Ⅲ級：在籠內活動減少并運動失調；Ⅳ級：當背部放在籠的底部時能滾動（翻正反射存在）但不能站立；Ⅴ級：翻正反射消失（Loss of righting reflex，LORR）但對疼痛刺激有肢體回縮反應；Ⅵ級：對任何刺激無反應。其中Ⅴ、Ⅵ級被認為是昏迷狀態［8］。本實驗中，我們以LORR作為昏迷的判別標準。

4 安放腦電皮層電極及側腦室套管 腹腔注射4%戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉大鼠后，安裝頭部電極和側腦室金屬套管，額葉電極：前囟前2mm，中線左旁開2mm；雙頂葉電極：中線左、右旁開4mm，前囟后6mm，深度（約0.7～1.0mm）觸及硬腦膜。埋置側腦室金屬套管參照Paxinos-Watson圖譜，中線旁1.5mm，前囟后1.5mm，深度3.0mm，自制套管直徑0.8mm。電極安放后，大鼠飼養2周。進行皮層腦電圖記錄時，將腦皮層電極導線連接到RM6240生理信號采集處理系統。記錄腦電圖，以δ波所占腦電波比例多少作為昏迷深度的判別指標。隨著昏迷深度增加，δ波所占腦電波的百分比增加。將給藥前δ波所占的百分比標準化為1，根據δ波百分比變化判斷給藥是否加深或減輕昏迷。

5 給藥方式 大鼠翻正反射消失后，各組均通過側腦室埋置的金屬套管微注射實驗藥物。對照組腦室注入 ACSF10μl；Orexin-A 組腦室注入 Orexin-A10μl（4nmol／10μl）；阻斷劑組腦室注入 Ritanserin 40μg／10μl；阻斷劑+Orexin-A組腦室注入Ritanserin 40μg／5μl后注入 Orexin-A5μl（4nmol／5μl）。

6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，所有計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間不同時間點比較采用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 側腦室不同給藥對酒精性昏迷大鼠LORR持續時間的影響 同對照組相比，給Orexin-A后LORR持續時間明顯縮短（2.90±0.30、1.85±0.35，P＜0.01）；而給5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林后，LORR持續時間明顯延長（2.90±0.30、4.47±0.49，P＜0.01）；在預先給予利坦色林處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，LORR持續時間無明顯縮短（2.90±0.30、3.11±0.48，P＞0.05），與 Orexin-A組比較LORR持續時間則明顯延長（P＜0.01）。見圖1。

側腦室不同給藥對酒精昏迷大鼠LORR持續時間影響

2 側腦室給藥后不同時間對酒精性昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響 對照組（人工腦脊液）隨著給藥時間延長，δ波相對百分比逐漸下降；同對照組相比，給Orexin-A后大鼠δ波相對百分比下降速率顯著加快（P＜0.01）；給予利坦色林組大鼠，5min后δ波相對百分比卻明顯升高（96.46±6.55、118.89±7.60，P＜0.01）；此外，先給利坦色林預處理然后再給Orexin-A，δ波相對百分比與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），但與Orexin-A組比較差異顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 側腦室給藥后不同時間對酒精昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響

討 論

昏迷的促醒治療具有重要的臨床意義。昏迷是覺醒系統結構受損或功能受抑所致［9］。傳統觀點認為，覺醒系統即是指腦干上行網狀激活系統。Orexins的發現是一個里程碑。目前觀點認為，下丘腦外側區的覺醒肽Orexins直接調節和影響著上行網狀激活系統的功能，被稱為機體的“覺醒啟動區”［9-10］。是調節睡眠和覺醒的關鍵神經元。賈曉軍研究發現其不僅可調節睡眠覺醒，還可對昏迷起促醒作用。本研究進一步探討其促醒機制。

5-羥色胺是傳統的興奮性神經遞質。5-羥色胺能神經元主要存在于低位腦干，其中中背縫核內（DR）是5-HT相對集中區。中背縫核同時也是重要的覺醒區域。Sakai等［11］運用在體單細胞神經元放電記錄方法研究發現覺醒期間5-HT能神經元放電活躍，而在慢波睡眠（SWS）期開始減少；Portas等［12］運用微量滲透方法研究發現腦中5-HT及其代謝產物含量在清醒期明顯升高。并發現5-HT與睡眠有著密切的關系，覺醒時5-HT系統激活，功能增高，睡眠時5-HT能系統功能降低，快眼動（REM）睡眠時最低。上述結果均提示5-HT與覺醒有關。Orexins神經元僅分布于下丘腦外側區（LHA），但Orexins神經元纖維投射到上行激動系統的廣泛區域，既往人們已認識到睡眠和覺醒之間的轉換是由單胺能（組胺，5-羥色胺，去甲腎上腺素）等興奮性神經遞質和腺苷、P物質、GABA能抑制性神經遞質等相互作用調節，但他們受何精確調節而實現睡眠和覺醒的轉換無法認知。Orexins的發現使人們認識到它的覺醒調節啟動作用，以及這些遞質與Orexins的關系。

近期研究發現Orexins的覺醒機制與傳統的興奮性單胺能神經遞質（5-羥色胺、組胺、5-HT）相關［3］。Wang等［13］通過免疫組化研究發現，背縫核的5-羥色胺能神經元活性受到Orexins系統的支配，Orexin-A通過Orexin-1受體對5-羥色胺能神經元起到調節作用。最近有實驗發現［14］，Orexin-A對麻醉大鼠具有促醒效應，這主要是通過5-羥色胺能神經元在快眼動睡眠及慢波睡眠期作用放電頻率增加實現的。上述研究結果證明Orexins對覺醒的促醒作用機制與5-羥色胺能系統有關。然而，Orexins對酒精性昏迷——這一臨床常見昏迷的促醒機制是否也與興奮單胺能神經系統（如5-羥色胺）相關？本研究針對這一問題進行了實驗論證。實驗運用兩種經典的監測手段——翻正反射消失（LORR）持續時間和皮層腦電圖來評判實驗大鼠的意識狀態［14］。其中，皮層腦電圖可連續監測皮層腦電活動狀況，且振幅比頭皮腦電圖大10倍，靈敏度高。昏迷時皮層腦區電活動頻率減慢、δ波所占比例明顯增加。采用向側腦室內給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林阻斷5-羥色胺能系統的激活，觀察對Orexin-A逆轉酒精性昏迷作用的影響。研究發現，與給予Orexin-A的促醒作用相反，給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林組大鼠，與對照組（人工腦脊液）比較，5min后δ波相對百分比明顯升高，并持續30min以上（圖2），LORR持續時間亦顯著延長（圖1），提示阻斷5-羥色胺遞質的作用可顯著加深昏迷的程度。進一步研究發現，先給予利坦色林預處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，δ波比例并沒有因Orexin-A而降低，LORR持續時間亦并沒有因Orexin-A的興奮性作用而縮短，Orexin-A的興奮作用被利坦色林阻斷。此結果提示5-羥色胺能系統的激活是Orexin-A對酒精性昏迷大鼠促醒的重要作用機制之一。

綜上，Orexin-A對酒精性昏迷大鼠有良好的促醒作用。其促醒作用機制，與5-羥色胺能系統的激活相關，為臨床昏迷的促醒研究及促醒藥物研制等提供了新線索。

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