蛋白印跡法檢測壽胎丸對反復自然流產模型小鼠子宮蛻膜的蛋白表達

雷 磊，李慧芳，譚展望，羅 蕾，盧麗麗

（1.湖南中醫藥大學分子病理實驗室，湖南 長沙410208；2.河北省婦幼保健中心婦女保健科，河北 石家莊050031）

前期通過雙相電泳及質譜技術發現并鑒定了30 個可能與復發性流產及壽胎丸干預相關的蛋白質，提示壽胎丸可調節復發性流產小鼠蛻膜組織多種蛋白質的表達[1]。課題組曾探討壽胎丸對反復自然流產小鼠母胎界面SOCS1 和SOCS3 蛋白表達的影響，結果表明壽胎丸可能通過降低小鼠母胎界面SOCS1 蛋白表達及提高SOCS3 蛋白表達，進而調控Th 細胞向Th2 方向分化，故對反復自然流產有治療作用[2-3]。本文應用蛋白印跡（western blot）技術對部分差異表達蛋白質的表達水平進行驗證。希望通過上述研究，對母胎界面的病理生理提供更為全面和有價值的信息，進而從分子水平探討壽胎丸安胎的作用機制，為中醫藥防治復發性流產提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雌性CBA/J 小鼠50 只，SPF 級，8 周齡，體質量（19.7±2.3）g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（京）2009-0004；健康雄性DBA/2 小鼠20 只，SPF 級，8 周齡，體質量 （24.7±2.5）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2007-0005；健康雄性BALB/C小鼠5 只，SPF 級，8 周齡，體質量（23.2±1.8）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 實驗藥物

壽胎丸由菟絲子、續斷、桑寄生和阿膠4 味中藥飲片按2∶1∶1∶1 比例組成，將前3 味藥混和，置圓底燒瓶中，加10 倍量水，加熱回流提取2 h，提取液濾過，殘渣加10 倍量水繼續加熱回流提取2 h，提取液濾過，合并2 次濾液，阿膠烊化于濾液中，濃縮至含生藥量1 g/mL，4 ℃保存備用。

1.3 主要儀器

BMJ-1 生物組織包埋機（天津航空機電公司）；Shandon325 石蠟切片機 （英國Shandon 公司）；LEICA DM LB2 雙目顯微鏡（德國LEICA 公司）；Motic B5 顯微攝像系統 （麥克奧迪實業集團公司）；MIAS醫學圖像分析系統（北航公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；紫外分光光度計 （美國Beckmen 公司）；垂直電泳槽、轉移電泳槽及電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；圖像掃描儀（美國Bio-Rad 公司）；Kodak Digital Science ID 圖像分析系統 （美國Kodak 公司）。

1.4 主要試劑

兔抗鼠熱休克蛋白27（HSP27）抗體、兔抗鼠α烯醇化酶（α-enolase）抗體、兔抗鼠轉鐵蛋白（Transferrin）抗體、兔抗鼠膜聯蛋白A2（Annexin A2）抗體、兔抗鼠β-actin 抗體、PVDF 膜、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、DAB 顯色試劑盒、ECL 發光試劑盒均購自美國Bethyl 公司。

2 方法

2.1 動物造模方法[4]

將50 只雌性CBA／J 小鼠分別與20 只雄性DBA／2 和5 只BALB／c 小鼠按2∶1 合籠交配，檢到陰栓者計為妊娠第0 d，分別建立反復自然流產模型40 只與正常妊娠模型10 只。

2.2 動物分組及給藥方法

CBA／J×BALB／c 孕鼠作為正常妊娠組（10 只），CBA／J×DBA／2 孕鼠作為反復自然流產模型（40只），按妊娠順序隨機分為模型組、壽胎丸低、中、高劑量組，每組10 只。壽胎丸劑量根據成人70 kg 臨床用量按動物體表面積換算，灌胃容積均為0.4 mL／20 g。其中壽胎丸低劑量組為臨床等效劑量，低、中、高劑量組給藥劑量分別為含生藥量3、6、12 g／kg。正常妊娠組和模型對照組給予相同體積蒸餾水，連續灌胃給藥14 d。

2.3 標本制備方法

孕14 d 斷頸處死小鼠，妊娠子宮離體后，自子宮角處鈍性撕開子宮壁，將胎兒胎盤單位從著床部位剝離，用小號組織剪刀分離著床部位的蛻膜組織，取5 個著床部位，用預冷的PBS 沖洗干凈后，迅速置液氮中保存。

2.4 western blot 分析方法

將蛻膜組織從液氮中取出，加入適量蛋白裂解液（按50 mg 標本用1 mL 裂解緩沖液），冰浴裂解1 h，12 000 r/min，4 ℃離心45 min，取上清即為蛻膜組織總蛋白。蛋白質濃度測定采用Amersham Biosciences 公司專門針對蛋白質組學研究的蛋白質抽提設計的2D Quant Kit 定量試劑盒。50 μg 總蛋白上樣進行SDS-PAGE 電泳，分離后的蛋白10 V恒壓25 min 轉移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶200 稀釋的HSP27 一抗4 ℃孵育過夜，再置于1∶1 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液中室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL發光液顯色曝光。同時以β-actin 作為上樣量的內參照，將所得X 光片掃描，記錄下來的照片通過計算機圖像分析系統，計算各實驗組指標與β-actin的光密度比值，作為HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2 的相對表達量。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 小鼠蛻膜組織HSP27 表達水平比較

以β-actin 蛋白作為內參，計算HSP27/β-actin比值并進行統計分析，結果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜HSP27 表達明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜HSP27 表達均降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜HSP27 表達較中、低劑量組明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 小鼠蛻膜HSP27 表達水平比較 （±s，n=10）

表1 小鼠蛻膜HSP27 表達水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 HSP27/β-actin 0.663 0±0.001 3 0.214 4±0.001 2**0.203 8±0.001 7**0.287 8±0.001 6**☆☆0.297 8±0.001 2**☆☆

圖1 HSP27 在各組細胞質內的表達電泳圖

3.2 小鼠蛻膜組織α-enolase 表達水平比較

以β-actin 蛋白作為內參，計算α-enolase/βactin 比值并進行統計分析，結果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜α-enolase 表達明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜α-enolase 表達均降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜α-enolase 表達與中、低劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2和圖2。

3.3 小鼠蛻膜組織Transferrin 表達水平比較

以β-actin 蛋白作為內參，計算Transferrin/βactin 比值并進行統計分析，結果顯示：小鼠模型組與正常組相比，蛻膜Transferrin 表達明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組與模型組相比，蛻膜Transferrin 表達升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸中、低劑量組與模型組相比，蛻膜Transferrin 表達差異無統計學意義 （P＞0.05）。見表3和圖3。

表2 小鼠蛻膜α-enolase 表達水平比較 （±s，n=10）

表2 小鼠蛻膜α-enolase 表達水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 α-enolase/β-actin 0.421 9±0.001 1 0.330 9±0.001 1**0.311 9±0.001 3**0.311 1±0.001 4**0.311 5±0.001 5**

圖2 各組中α-enolase 的表達電泳圖

表3 小鼠蛻膜Transferrin 表達水平比較 （±s，n=10）

表3 小鼠蛻膜Transferrin 表達水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 Transferrin/β-actin 0.2611±0.0012 0.4912±0.0011**0.4501±0.0012**0.2626±0.0015☆☆0.2632±0.0016☆☆

圖3 各組中Transferrin 的表達電泳圖

3.4 小鼠蛻膜組織Annexin A2 表達水平比較

以β-actin 蛋白作為內參，計算Annexin A2/βactin 比值并進行統計分析，結果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜Annexin A2 表達明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜Annexin A2 表達均升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜Annexin A2 表達較中、低劑量組明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表4和圖4。

表4 小鼠蛻膜Annexin A2 表達水平比較 （±s，n=10）

表4 小鼠蛻膜Annexin A2 表達水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 Annexin A2/β-actin 0.333 4±0.001 3 0.549 8±0.001 1**0.536 5±0.001 3**0.462 0±0.001 2**☆☆0.462 6±0.001 2**☆☆

圖4 各組中Annexin A2 表達的影響電泳圖

4 討論

Western blot 技術是一種利用抗原-抗體反應的特異性，快速、靈敏地檢測和鑒定蛋白質的技術，它將蛋白質的電泳分離和免疫學鑒定結合在一起，該技術有效克服了免疫沉淀技術中的某些不足 （如抗原須用同位素標記、緊密相關大分子的共沉淀、抗原的溶解度等)，非常實用而被廣泛接受。用SDS、尿素或還原劑(2-巰基乙醇等)增溶抗原混合物后，進行SDS-PAGE，然后將被分離的蛋白質電轉移至硝酸纖維素薄膜，并與之不可逆地結合。隨后封閉薄膜上非特異性的抗體結合位點，再與靶抗體特異性結合，最終與HRPO-Ig 偶聯物保溫，從顏色反應的深度探測膜上印跡蛋白抗原的存在與含量[5]。

前期研究建立了模型組、正常組、壽胎丸高、中、低劑量組小鼠蛻膜組織的2-DE 圖譜，通過比較各組雙向凝膠電泳圖譜的差異，發現并鑒定了30 個可能與復發性流產及壽胎丸干預相關的蛋白質，這些蛋白質的功能涉及絨毛外滋養細胞的侵襲、蛻膜組織血管的重建及蛻膜細胞的凋亡等[1]。由于在實驗過程中，可能會出現假陽性的實驗結果，故采用Western-blot 從蛋白質水平進行驗證，驗證得到的陽性結果才是真正的差異表達蛋白質[6]。

Hsp27 是小分子熱休克蛋白，與妊娠的關系逐漸受到重視，其與滋養細胞遷移、胎兒發育、分娩發動、子癇前期發病密切相關[7]。Hsp27 可能通過直接影響細胞骨架蛋白結構或通過影響MMP-2 活性，而干擾滋養細胞遷移，影響胎盤形成[8]。Hsp27 是P29 雌激素受體連接蛋白，可與雌激素受體相互作用，影響胎兒發育[9]。α 烯醇化酶（α-enolase）普遍存在于生物體內。在糖酵解過程中，它催化a 磷酸甘油形成磷酸烯醇式丙酮酸。主要參與過敏性反應、低氧耐受性、控制生長等多種細胞生理過程，并且還是幾種細胞表面纖溶酶的受體和激活物[10]。轉鐵蛋白（Transferrin）-轉鐵蛋白受體（Transferrin R）途徑是哺乳動物組織細胞生理條件下主要的攝鐵途徑，同樣在胎盤鐵轉運中也起關鍵作用。胎盤合體滋養層細胞母體側（頂膜）主要表達Transferrin R1，母體血液中Fe3+-Transferrin 與STB 頂膜上TransferrinR1 結合成Transferrin-TransferrinR 復合物被內吞，在內吞小體酸性環境下，Fe3+從Tf 中釋放，脫鐵Transferrin 和TransferrinR 被運回胞外可繼續利用[11]。膜聯蛋白A2（Annexin A2） 是鈣離子依賴的磷脂結合蛋白Annexins 家族的重要成員之一，研究顯示，子疒間前期患者Annexin A2 表達水平下調，可能會增加凝血酶的合成，進而促進妊娠期高凝狀態的形成，從而在子疒間前期的發生、發展中發揮作用。此外，來自栓塞性腦卒中大鼠模型的證據表明靜脈注射重組Annexin A2 能明顯抑制體內血栓的形成[12]。

本研究采用Western blot 法檢測了模型組、正常組、壽胎丸高、中、低組小鼠蛻膜組織的HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2，結果與蛋白質組學分析結果一致，從一定程度上證明了蛋白質組學實驗方法的穩定性及其結果的準確性；壽胎丸通過下調復發性流產小鼠蛻膜組織HSP27、α-enolase 蛋白的表達，緩解氧化應激反應，改善蛻膜組織的缺氧狀態，逆轉細胞內ATP 的產生途徑，同時上調Transferrin、Annexin A2 蛋白的表達，提高攝取母血鐵能力，改善蛻膜組織的高凝狀態，預防血栓形成，保持血流通暢，從而實現維持妊娠，降低胚胎丟失率，這可能是其安胎的作用機制之一。

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