活血、破血藥對動脈粥樣硬化大鼠PCNA蛋白、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA表達(dá)的影響

謝海波，羅堯岳，莫新民，吳亦之，盧 青，徐豫湘，李 武

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410007）

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)之一，是一種常見病、多發(fā)病。根據(jù)AS 的表現(xiàn)，中醫(yī)可將其歸為“血瘀”、“瘕結(jié)”等范疇，常采用活血化瘀藥治療。活血化瘀藥有活血止痛、活血調(diào)經(jīng)、活血療傷、破血消癥之分[1]。總的來說，根據(jù)活血化瘀程度不同，可分為活血和破血兩類。本研究選用活血藥當(dāng)歸、川芎和破血藥三棱、莪術(shù)，觀察兩類藥對AS 大鼠主動脈內(nèi)膜增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）VEGFmRNA、血管內(nèi)皮生長因子受體 （VEGFR）VEGFR-2mRNA 表達(dá)的影響，探討二者的作用差異，為臨床處方選藥提供實驗依據(jù)。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，60 只。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCxk 豫2005-001。

1.1.2 藥物 當(dāng)歸、川芎和三棱、莪術(shù)均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，常規(guī)煎煮，制成含生藥0.18 g/mL 的藥液，5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 膽固醇由中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司提供（批號：20080923）；膽酸鈉由上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司提供（批號:080628）；維生素D3注射液由蘇州第六制藥廠生產(chǎn)（批號:070621）；丙基硫氧嘧啶由南通精華制藥股份有限公司生產(chǎn) （批號:080701）；阿托伐他汀（立普妥）由大連輝瑞制藥有限公司分裝 （批號:85837034）；豬油購自農(nóng)貿(mào)市場。PCNA 免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供 （編號：BM0104）；VEGF 原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供 （編號：MK1142）；VEGFR-2 原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供（編號：MK1145）。

1.1.4 儀器 JY3002 型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS-2 電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海南陽儀器有限公司；LEICA DM LB2 型雙目顯微鏡：德國LEICA 公司；Shandon325 型石蠟切片機：英國Shandon 公司；7170A日立全自動生化分析儀：日本日立公司；TDZ4-WS 低速臺式離心機：上海華巖儀器設(shè)備有限公司；MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)：北航公司；Haier 醫(yī)用微波爐：Haier 集團；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；S2-93 自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按隨機數(shù)字表法將60 只大鼠分為5 組，即空白組、模型組、活血藥（當(dāng)歸、川芎）組、破血藥（三棱、莪術(shù)）組、他汀組，每組12 只。

1.2.2 造模方法 空白組每日給予普通飼料，其它各組大鼠首先腹腔注射維生素D3(70 萬IU／kg，分3 次，每2 d 注射1 次)，然后各組每日每只給予高脂飼料（2%膽固醇，0.5%膽酸納，3%豬油，0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基礎(chǔ)飼料）20 g，連續(xù)喂飼12 周[2-3]。隨機抽取2 只大鼠，處死后速取主動脈，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，石蠟包埋切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)已形成粥樣硬化斑塊，證實造模成功。

1.2.3 給藥劑量及方法 造模成功后，按成人體質(zhì)量70 kg 等劑量計算大鼠用藥劑量，灌胃給藥，每天1 次，灌胃體積10 mL/kg，空白組、模型組灌服等體積白開水；活血藥組灌服當(dāng)歸、川芎煎液，給藥體積10 mL/(kg·d)，給藥劑量為1.8 g/（kg·d）；破血藥組灌服三棱、莪術(shù)煎液[給藥體積10 mL/(kg·d)，給藥劑量1.8 g/（kg·d）]；他汀組灌服阿托伐他汀給藥體積10 mL/(kg·d)，給藥劑量0.001 8 g/kg，各組給藥劑量均一，連續(xù)用藥4 周。

1.2.4 指標(biāo)檢測 （1）主動脈內(nèi)膜PCNA 蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化染色法，具體操作方法按試劑盒說明書進行。（2） 主動脈內(nèi)膜VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 表達(dá)的檢測 采用原位雜交法檢測，操作步驟按試劑盒說明書進行。（3） 結(jié)果判斷①PCNA 以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性。每張切片在40 倍物鏡下隨機選取4 個視野，用圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞數(shù)。②VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA以細(xì)胞膜或胞漿著色呈棕黃色為陽性。每張切片在40 倍物鏡下隨機選取4 個視野，用圖像分析軟件測定VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 陽性表達(dá)強度的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組主動脈內(nèi)膜PCNA 表達(dá)的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示：空白組可見PCNA 陽性表達(dá)，模型組、他汀組、活血組和破血組PCNA 陽性細(xì)胞表達(dá)增多。

模型組PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)高于空白組、他汀組、活血組和破血組（P＜0.05）；破血組PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)低于活血組（P＜0.05），二者組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組主動脈PCNA 表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù) （n＝10，±s）

表1 各組主動脈PCNA 表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù) （n＝10，±s）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與活血組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別空白組模型組他汀組活血組破血組給藥劑量（g/kg）— —0.001 8 1.80 1.80陽性細(xì)胞數(shù)58.9±7.26△△**93.7±9.93*79.7±7.18△81.2±7.21△68.8±8.39△△*

2.2 各組VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 表達(dá)的比較

原位雜交結(jié)果顯示：空白組可見VEGFmRNA及VEGFR-2mRNA 陽性表達(dá)，模型組、他汀組、活血組和破血組VEGFmRNA 及VEGFR-2mRNA 陽性表達(dá)信號增多。

模型組VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 平均灰度值均高于空白組、他汀組、活血和破血組（P＜0.05）；活血組、破血組組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA平均灰度值比較 （n＝10，±s）

表2 各組VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA平均灰度值比較 （n＝10，±s）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與活血組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別空白組模型組他汀組活血組破血組給藥劑量（g/kg）——0.001 8 1.80 1.80 VEGFmRNA 70.5±8.77△△**111.4±13.34*82.7±12.16△△90.5±10.74△83.4±10.33△△VEGFR-2mRNA 62.1±8.65△△103.5±12.66**76.1±13.75△△82.9±15.47△75.1±11.69△△

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的增殖可以促進血管形成[4]。生理性血管形成對血管的生成、成長和修復(fù)至關(guān)重要；病理性血管形成是AS 一個重要特征[5]。最近越來越多的證據(jù)表明，VEGF 與AS 的進展和斑塊不穩(wěn)定性有密切關(guān)系，可通過炎癥浸潤和新生血管形成等機制促進粥樣硬化損傷的進展。

VEGF 是目前已知的功能最強的促有絲分裂素，特異的作用于VEC，誘導(dǎo)VEC 的增生、遷移，在生理性和病理性血管形成過程中發(fā)揮著重要作用。VEGFR 介導(dǎo)了一系列細(xì)胞行為包括細(xì)胞遷移、存活、增殖等。VEGFR-2 主要功能是在各種生理病理情況下介導(dǎo)新生血管的形成。近來的研究表明，VEGF／VEGFR-2 促進VEC 增殖和存活的作用還需要細(xì)胞表面黏附蛋白的參與[6]。PCNA 即細(xì)胞增殖核抗原，是一種在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核抗原，相對分子質(zhì)量約為36×103，是真核細(xì)胞DNA 聚合酶δ 的輔助因子，與DNA 合成和細(xì)胞增殖相關(guān)[7]。

黃正華等[8]研究川芎嗪對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：川芎嗪對條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC 增殖有明顯抑制作用，增殖抑制率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高。劉凱[9]觀察當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)VEGFmRNA 表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV-304 細(xì)胞有促增殖的作用，其機制是通過誘導(dǎo)ECV-304 細(xì)胞VEGFmRNA 表達(dá)實現(xiàn)的。葉蘭等[10]研究提示三棱、莪術(shù)含藥血清可抑制VEGF 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其機制與抑制VEGF 表達(dá)密切相關(guān)。目前研究多局限于某一種或幾種活血化瘀藥或有效成分對VEC 增殖的調(diào)節(jié)作用，而未見有將活血藥、破血藥對VEC 增殖的調(diào)節(jié)作用進行比較研究的報道。

我們前期研究表明[11]：活血藥（當(dāng)歸、川芎）、破血藥（三棱、莪術(shù)）均能降低AS 大鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC），且在降低LDL-C 的幅度上破血藥（三棱、莪術(shù)）大于活血藥（當(dāng)歸、川芎），但二者間無統(tǒng)計學(xué)意義，提示兩者均有抗AS 作用。本實驗從VEC 增殖角度出發(fā)，選擇PCNA 蛋白、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 作為觀察指標(biāo)，探討活血藥（當(dāng)歸、川芎）、破血藥（三棱、莪術(shù)）抗AS 的作用機制及差異。實驗結(jié)果初步表明：活血藥（當(dāng)歸、川芎）、破血藥（三棱、莪術(shù)）均能 抑 制PCNA、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 的 表達(dá)，在抑制PCNA 表達(dá)方面，破血藥三棱、莪術(shù)優(yōu)于活血藥當(dāng)歸、川芎。此結(jié)果表明二者均有抑制VEC增殖作用，但在作用環(huán)節(jié)和靶點上有一些差異，這種差異能否說明破血藥（三棱、莪術(shù)）在抑制VEC 增殖上優(yōu)于活血藥（當(dāng)歸、川芎）仍有待進一步研究。

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