黃芪甲苷對阿霉素心肌損傷的保護作用及Daxx表達的影響

鐘 飛，周衛華，張 潔，楊梅松竹，石慧娟，彭英福，李雙杰

（1.吉首大學醫學院，湖南 吉首416000；2.湖南省兒童醫院肝病中心，湖南 長沙410007）

心肌細胞凋亡是在一定生理和病理條件下，通過特殊信號轉導途徑，激活細胞“自殺”程序，在基因調控下進行的程序化死亡。目前認為心肌細胞凋亡是心血管疾病發生發展的細胞學基礎，在心肌病的發生發展過程中起重要作用[1]。心肌組織死亡結構域相關蛋白（Daxx）是（death domain-associated protein，Daxx）是Yang[2]等在1997年發現的一種Fas 死亡結構域結合蛋白，可激活c-Jun 氨基末端激酶 （c-Jun Nterminal kinase，JNK） 通路誘導細胞凋亡；研究顯示，干預Daxx 在心肌中的表達，可減少大鼠心肌梗死的面積與心肌細胞的凋亡[3]，我們推測Daxx 可能成為調節細胞凋亡新的重要藥理作用靶點，我們以前的研究表明黃芪甲苷具有減少阿霉素性致心肌細胞凋亡作用，本研究在前期工作的基礎上，進一步探討黃芪甲苷調控心肌細胞凋亡的作用機制，為開發研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD 大鼠30 只，SPF 級，體質量200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 藥物 黃芪甲苷(成都錦泰和醫藥化學技術有限公司)，保存于4 ℃冰箱，用甲基纖維素鈉配成5 mg/mL；阿霉素（購自湘西自治州腫瘤醫院）。

1.1.3 試劑 山羊抗Daxx 抗體、辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IG、β-actin 小鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠IG、complete TM pretease inhibitor cocktail tablet，均由Santa 公司公司提供。PageRulerTM Puls pertained protein ladder(fermentas 公司)；硝酸纖維膜、BCA 蛋白濃度測定試劑盒，ECL 超敏化學發光試劑，均由江蘇南通碧云天生物技術研究所提供；RIPA Lysis buffer(Millipore 公司)；PE 導管（內徑0.58 mm，外徑0.99 mm，美國健康醫療儀器國際公司）。

1.1.4 儀器 TGL-16G 冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠生產)；723 可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；萊卡切片機（RM2126 上海）；全自動生物組織脫水機（YD-12G 金華益迪醫療設備有限公司）；生物組織包埋機(YD-6L 產地金華益迪醫療設備有限公司)；紫外分光光度計（UV-3100 產地上海美普達儀器有限公司），DYCZ 雙板夾芯式垂直槽 （北京六一廠）；半干式碳板轉移電泳槽 （北京六一廠）；BL-420E 生物機能實驗系統（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠隨機分為3 組，即空白組、模型組、黃芪甲苷組，每組10 只。

1.2.2 造模方法 參照文獻用阿霉素造模[4]2.5 mg/kg，隔日1 次腹腔注射，每周3 次，共2 周，總劑量為15 mg/kg。

1.2.3 給藥方法 空白組采用生理鹽水0.6 mL 腹腔注射，隔日1 次，共6 次，同時用1%羧甲基纖維素鈉1 mL，灌胃1 次／d。模型組采用阿霉素造模(2.5 mg/kg，隔日1 次腹腔注射，共6 次，總劑量為15 mg/kg)；同時灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉1 mL，1 次/d。黃芪甲苷組造模方法同模型組，同時灌胃給予黃芪甲苷[5]30 mg/kg(用1 mL 1%甲基纖維素鈉溶解)，1 次/d 灌胃，連續2 周。

1.2.4 心功能檢測 最后1 次阿霉素處理24 h 后，用20%烏拉坦4 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，頸部正中切口，游離右頸總動脈，經右頸總動脈向左心室插入自制的心室插管（內徑0.58 mm，外徑0.99 mm）導管內充滿1%的肝素，穩定20 min后，用數據采集和分析系統測量左室收縮壓（LVSP）、左室內壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）等心功能指標。

1.2.5 心肌損傷理學檢測 心功能測定后，斷頭處死，用預冷的生理鹽水洗凈殘血，取部分心肌10%的甲醛固定24 h，常規脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE 染色，光學顯微鏡觀察結果并照相。

1.2.6 心肌生化指標的檢測 心功能測定后，斷頭處死，用預冷的生理鹽水洗凈殘血，取中下部分心肌，-80 ℃保存備用，取部分心肌勻漿測定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，TBA法測定MDA 含量，羥胺法測定SOD 活性，蛋白質定量用BCA 法，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7 蛋白電泳和蛋白免疫印跡 （western-blot）檢測死亡結構域相關蛋白（Daxx）表達 取心肌組織約50 mg，用用預冷的RIPA Lysis buffer 加omplete TM pretease inhibitor 500 μL，用勻漿器破碎細胞，4 ℃，12 000 g，離心10 min，取上清液，用BCA 法蛋白定量，取100 μg 蛋白，10%分離膠和4%濃縮膠SDS-PAGE 膠電泳3 h，蛋白經半干電轉膜系統轉至硝酸纖維膜，10%脫脂奶粉封閉1 h，加山羊抗大鼠Daxx 抗體（1∶500），4 ℃過夜，TTBS 洗3 次，10 min/次，驢抗山羊IG（1∶1 000），37 ℃振蕩孵育2 h，TTBS 洗3 次，10 min/次，加ECL 反 應 液5 min，暗室暴光，壓片，用凝膠成像分析系統攝像分析。

1.3 統計學分析

所有數據采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，采用“±s”表示，組間比較用方差分析和兩兩比較S-N-K 法，P＜0.05 示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP、±dp/dtmax 等心功能的影響

與空白組相比，模型組大鼠心肌LVSP，±dp/dtmax 等指標顯著降低，提示其心功能顯著下降。灌胃給予黃芪甲苷后，大鼠心肌LVSP，±dp/dtmax 等指標與模型組相比明顯改善。結果見表1。

表1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP，±dp/dtmax等心功能的影響 （±s，n=10，mmHg/s）

表1 黃芪甲苷對大鼠心臟LVSP，±dp/dtmax等心功能的影響 （±s，n=10，mmHg/s）

注：與空白組相比**P＜0.01，與模型組相比＃P＜0.05。

組 別空白組模型組黃芪甲苷組LVSP 135.64±11.2 96.82±7.46**119.17±10.23＃+dp/dtmax 5 769±1 104 2 876±976**4 376±1 146＃-dp/dtmax 5 216±1 214 2 347±942**3 615±1 087＃

2.2 黃芪甲苷對阿霉素大鼠心肌組織病理的影響

空白組心肌細胞排列整齊，胞核清晰，無心肌纖維的破壞，細胞間隙正常，未見水腫，組織間隙無炎性滲出。模型組心肌細胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性壞死，心肌壞死灶內可見單核、淋巴細胞浸潤。黃芪甲苷組病變明顯減輕，心肌細胞水腫減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，肌原纖維排列較整齊，心肌細胞胞間隙增寬，心肌間可見部分紅細胞浸潤。見圖1。

圖1 黃芪甲苷對阿霉素大鼠心肌組織病理影響的光鏡圖(HE 染色，×400)

2.3 黃芪甲苷對心肌生化指標的影響

模型組大鼠心肌組織MDA 含量升高，與空白相比差異有統計學意義（P＜0.01）；模型組大鼠心肌組織SOD 和GPX 活性下降，與空白相比差異有統計學意義（P＜0.01）；灌胃給予黃芪甲苷后，大鼠心肌組織MDA 含量下降，大鼠心肌組織SOD 和GPX 活性升高，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表2。

表2 黃芪甲苷對大鼠心肌組織SOD、GPX 活性和MDA 含量的影響 （±s，n=10）

表2 黃芪甲苷對大鼠心肌組織SOD、GPX 活性和MDA 含量的影響 （±s，n=10）

注：與空白組相比**P＜0.01，與模型組相比△P＜0.05。

組 別空白組模型組黃芪甲苷組SOD(U/mg)18.40±2.98 10.79±1.96**15.48±2.49△GPX(U/mg)42.56±5.29 28.74±3.67**35.08±2.95△MDA(nmol/mg)9.36±1.34 16.34±2.86**12.82±1.89△

2.4 western-blot 結果

與空白組相比，模型組大鼠心肌組織Daxx 增加至正常水平的（2.95±0.38）倍(P＜0.01)，黃芪甲苷灌胃給藥后大鼠心肌組織中daxx 的表達增加至正常水平的（1.93±0.46）倍，與模型組相比差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖2。

3 討論

圖2 大鼠心肌組織中Daxx 蛋白免疫印跡檢測圖

普遍認為阿霉素誘導的心肌損傷與過量氧自由基的產生有關[1，6]，它導致細胞膜脂質過氧化，引起細胞膜的直接損害。本實驗中模型組大鼠心肌組織中得MDA 含量顯著升高，SOD 和GSH-PX 活性顯著降低（P＜0.05），表明ADR 引起明顯心肌細胞脂質過氧化反應，導致心肌細胞損傷，這與文獻報道一致[7]。模型組病理結果可見心肌細胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性變性和壞死；測定LVSP、±dp/dtmax 等心功能指標，模型組LVSP，±dp/dtmax 等指標顯著惡化，阿霉素組大鼠出現了左室收縮功能障礙，證實阿霉素心肌損傷模型是成功的。

近年來的研究證實阿霉素導致心肌細胞凋亡在其對心肌的毒性損傷機制中起重要的作用[8]。Fas（CD95）為死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員。FasL（又名CD178）為腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體。當表達Fas 的靶細胞和活性細胞的FasL 交聯后，啟動凋亡信號傳導途徑，從而激活Fas/FasL 途徑下游的白細胞介素-1β 轉化酶的相關蛋白酶系列，引起核酸內切酶活化，降解DNA 修復酶及細胞骨架調節蛋白，最終導致Fas 表達陽性的靶細胞凋亡[9]。Fas/FasL 系統介導的凋亡信號傳導途徑是許多心血管疾病發生發展的重要機制。Kim 研究首先證實daxx 在氧化應激誘導的細胞凋亡中發揮重要作用[10]，H2O2處理細胞能誘導Daxx 表達上調，而用反義寡核苷酸抑制daxx 的表達能抑制H2O2誘導的細胞凋亡。Yaniv 研究[11]進一步探明了daxx誘導細胞凋亡的作用機制，首先H2O2激活Fas，Fas的死亡結構域可與Daxx 的C 末端一個功能區結合，通過激活C-Jun 氨基末端激酶（JNK）途徑而啟動凋亡的發生。我們的實驗結果表明，daxx 在阿霉素心肌損傷大鼠心肌中表達升高，表明daxx 可能通過Fas-daxx-JNK 介導了阿霉素誘導的細胞凋亡。

黃芪甲苷為中藥黃芪的重要的活性成分，研究表明其對病毒性心肌炎具有良好的治療效果，能改善病毒性心肌損傷大鼠心功能、減輕心肌損傷病理改變[12]。我們以前的研究證實黃芪甲苷可以顯著減少阿霉素所誘導的心肌細胞凋亡[13]；本研究表明黃芪甲苷能降低阿霉素大鼠心肌組織MDA 含量，升高SOD 和GSH-PX 活性；明顯減輕其病理改變程度，黃芪甲苷能下調阿霉素心肌損傷大鼠心肌組織daxx 的表達從而起到抑制心肌細胞凋亡的作用，明顯改善其心功能。綜上所述daxx 在阿霉素心肌損傷大鼠心肌中表達上調，并在阿霉素心肌損傷的發生發展中起一定的作用，黃芪甲苷能下調daxx 的表達，改善阿霉素心肌損傷大鼠的心功能，減輕病理損害，其機制可能與其清除氧自由基、抑制細胞凋亡等作用有關。

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