五倍子多糖脫蛋白方法的研究

龔力民，劉 偉，張楚晗，李順祥，張紅剛，湯先赤，王文茂

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.張家界奧威科技有限公司，湖南 張家界427000）

五倍子(Galla chinensis)，性寒，味酸、澀。具有斂肺降火、澀腸止瀉等多種功效，臨床上主要用于肺熱痰嗽、外傷出血、癰腫瘡毒等[1]。五倍子由于具有多種藥用價(jià)值和保健作用，已逐漸深受研究人員的重視，但目前對(duì)五倍子的研究大部分都集中于其主要成分單寧酸的分離提取及其化學(xué)和藥理研究，關(guān)于五倍子多糖的研究報(bào)道尚不多見。多糖近年來(lái)已成為生命科學(xué)中最為活躍的研究領(lǐng)域之一，其在降血糖、免疫、抗衰老等方面表現(xiàn)出卓越的生物活性。五倍子粗多糖系從五倍子藥材中提取的多糖。用水提取的多糖，常含有一定量的蛋白質(zhì)。因此，如何盡量多地去除蛋白質(zhì)而保留多糖成為多糖純化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本文對(duì)五倍子粗多糖進(jìn)行除蛋白方法的研究，通過(guò)對(duì)Sevag 法、蛋白酶法以及兩者聯(lián)用法三種方法的比較，對(duì)五倍子粗多糖中蛋白質(zhì)的去除方法進(jìn)行了初步探討。

1 儀器與試藥

752N 型紫外可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、T-214 電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、DZF 真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療器械儀器廠）?？捡R斯亮藍(lán)G-250（AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、牛血清白蛋白（99%，Amresco 公司）、木瓜蛋白酶（高純級(jí)，Bomei 公司）、其余試劑均為分析純；水為蒸餾水。

五倍子由張家界奧威科技有限公司提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)李順祥教授鑒定為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill.葉上的蟲癭。60 ℃烘干，粉碎，過(guò)60 目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 五倍子多糖的提取

取五倍子粉100 g，加10 倍量蒸餾水，60 ℃超聲（20 KHz，600 W）提取2 次，每次20 min，合并水提液，離心，取上清液，濃縮至小體積，加3 倍95%乙醇醇沉，離心取沉淀，60 ℃減壓干燥得五倍子粗多糖。

2.2 多糖和蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

2.2.1 樣品溶液的配制 取五倍子粗多糖約4.0 g，精密稱定，加水溶解并定容至200 mL，搖勻，即得樣品溶液（20.00 mg/mL），作為脫蛋白前的準(zhǔn)備液。

2.2.2 多糖的測(cè)定[1]按《中華人民共和國(guó)藥典》的硫酸-苯酚法制備A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：

A=0.010 06C+0.005，r=0.997 5。

線性范圍為10.5～63.0 μg/mL，同時(shí)進(jìn)行樣品的測(cè)定，計(jì)算樣品中的多糖含量。

2.2.3 蛋白質(zhì)的測(cè)定[2]按《中華人民共和國(guó)藥典》的考馬斯亮藍(lán)法制備A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：

A=0.008 5C+0.019，r=0.998 8。

線性范圍為12.5～62.5 μg/mL，同時(shí)進(jìn)行樣品的測(cè)定，計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

2.3 五倍子多糖除蛋白方法篩選[3]

樣品溶液分別采用Sevag 法、蛋白酶法和兩者聯(lián)用法進(jìn)行除蛋白處理。

2.3.1 Sevag 法 取30 mL 樣品溶液3 份，各加入7.5 mL 的三氯甲烷-正丁醇 (4∶1），混勻振蕩20 min，離心分去水相與有機(jī)相交界處的變性蛋白質(zhì)，反復(fù)5 次。將上層多糖溶液定容至50 mL，測(cè)定蛋白去除率和多糖損失率，測(cè)定結(jié)果見表1。

2.3.2 酶解法 取30 mL 樣品溶液3 份，各加入底物2%（12 mg）的木瓜蛋白酶，在60 ℃水浴中酶解反應(yīng)2 h，90 ℃高溫滅酶5 min，離心棄去沉淀，將上清液定容至50 mL。測(cè)定蛋白去除率和多糖損失率，見表1。

2.3.3 兩者聯(lián)合法(酶解法+Sevag 法) 取30 mL 樣品溶液3 份，各加入底物2%（12 mg） 的木瓜蛋白酶，在60 ℃水浴中酶解反應(yīng)2 h，反應(yīng)完后90 ℃高溫滅酶5 min，離心，棄去沉淀，上清液再按Sevag法操作，重復(fù)5 次，直到無(wú)變性蛋白產(chǎn)生為止，將上清液定容至50 mL，測(cè)定蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率，見表1。

2.3.4 除蛋白后總固物含量測(cè)定 取30 mL 樣品溶液3 份，分別照“2.3.1 項(xiàng)”、“2.3.2 項(xiàng)”、“2.3.3 項(xiàng)”方法處理樣品，收集所有除蛋白后的溶液，干燥，105 ℃烘干至恒重，精密稱重，換算成除蛋白后總固物質(zhì)量。測(cè)定結(jié)果見表1。

2.4 三種脫蛋白方法的比較

由表1可知，Sevag 法和聯(lián)合法脫蛋白的效率最高，酶解法最低。從多糖的損失率來(lái)看，Sevag 法損失率最高，酶解法最低。這主要是由于Sevag 試劑（三氯甲烷和正丁醇）與多糖溶液萃取時(shí)所形成的凝膠物中會(huì)包裹少量多糖物質(zhì)，容易造成樣品的損失，導(dǎo)致多糖損失率較高。木瓜蛋白酶除蛋白，由于酶的降解作用，使得大部分的游離蛋白質(zhì)和部分結(jié)合蛋白質(zhì)水解，因而聯(lián)合使用時(shí)可以大大減少后續(xù)Sevag 試劑的使用次數(shù)，多糖損失率也較單用Sevag法時(shí)降低。所以本試驗(yàn)確定五倍子粗多糖以蛋白酶+ Sevag 法除蛋白為宜，即先用木瓜蛋白酶降解蛋白質(zhì)，然后用Sevag 法3 次除去剩下的蛋白質(zhì)。

表1 三種脫蛋白方法的測(cè)定結(jié)果

2.5 方法的條件優(yōu)化

確定五倍子粗多糖除蛋白法為木瓜蛋白酶+Sevag 法后，對(duì)此方法進(jìn)行條件優(yōu)化。采用單因素試驗(yàn)法，分別考察蛋白酶加入量、酶解pH 以及酶解溫度對(duì)脫蛋白的影響，以獲得最佳酶法脫蛋白條件。如圖1。

圖1 單因素對(duì)脫蛋白的影響折線圖

綜上所述，用木瓜蛋白酶+ Sevag 聯(lián)合法脫除五倍子粗多糖的蛋白質(zhì)的具體條件是：酶用量為底物的2.0%、酶解pH=5、酶解溫度50 ℃和反應(yīng)時(shí)間2 h，用此酶解條件和Sevag 法聯(lián)用，可取得最優(yōu)的除蛋白效果。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果蛋白質(zhì)脫除率為84.5%，多糖損失率為17.9%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)五倍子多糖脫蛋白方法進(jìn)行了研究，采用蛋白脫除率和多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)脫蛋白方法進(jìn)行了篩選，最后得到了較為理想的蛋白酶+Sevag 聯(lián)合法：即先用木瓜蛋白酶降解蛋白質(zhì)，然后用Sevag 法三次除去剩下的蛋白質(zhì)，最后產(chǎn)品為棕色粉末狀。經(jīng)過(guò)脫蛋白處理，粗多糖得到純化精制，為五倍子多糖的綜合利用和后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供了有利條件。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：62，233.

[2]董 潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，22(6)：40-43.

[3]陳占科，王淑美，高 珊，等.制何首烏多糖的脫蛋白研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2011，17(4)：41-43.