超高壓液相色譜熒光檢測法快速測定水中痕量苯胺與聯苯胺

王 超，呂怡兵，滕恩江，加那爾別克·西里甫汗，許人驥

(1.中國環境監測總站，北京 100012;2.新疆環境監測總站，新疆自治區 烏魯木齊 830011)

苯胺和聯苯胺是化工、印染和制藥等工業生產的重要原料，釋放到環境中會通過皮膚、呼吸道和消化道進入人體，嚴重威脅人類健康。苯胺可造成急/慢性中毒，引起高鐵血紅蛋白癥、神經衰弱、輕度貧血等;聯苯胺可引起接觸性皮炎、出血性膀胱炎和膀胱癌，被國際癌癥研究機構(IARC)認定為1類致癌物質(對人類致癌性證據充分)［1－2］。因此，美國、日本等國將其列入主要監測項目或優先監測的污染物黑名單［3］。我國將苯胺和聯苯胺列為環境重點污染物，并在《地表水環境質量標準》(GB 3838－2002)中規定苯胺和聯苯胺的標準限值分別為100 μg/L和0.2 μg/L。因此開發一種高靈敏并且簡單實用的方法，對于控制水體中苯胺和聯苯胺的污染，保證人類用水安全，具有重要意義。

目前已開發基于不同檢測原理的方法主要有萘乙二胺偶氮光度法(NEAP)［4］、液相色譜紫外吸收法(HPLC/UV)［5－6］、液相色譜電化學檢測法(HPLC － EC)［7］、氣相色譜質譜法(GC － MS)［8］、超臨界流體色譜法［9］、電極法［10］、電化學發光猝滅法(ECIQ)［11］、直接電化學法［12］、毛細管電泳法(CE)［13］、共振光散射法(RLS)［14］、表面增強拉曼散射法(SERS)［15］。有文獻報道［16－17］可采用液相色譜熒光檢測法直接測定水中的苯胺，但分析時間較長且靈敏度不高。對于比苯胺的地表水環境質量規定濃度低500倍的痕量聯苯胺，現有成熟的方法均需經過復雜的富集濃縮過程，才能滿足水質監測需求。超高壓液相色譜由于采用亞2 μm粒徑填料的色譜柱，可得到比常規HPLC更快的分離速度和更高的靈敏度［18］，近年來在環境監測、食品藥品分析等領域得到越來越廣泛的應用［19－20］。目前未見關于超高壓液相色譜熒光檢測法直接測定水中苯胺和聯苯胺的報道。

本研究建立的直接進樣/超高壓液相色譜熒光檢測法，具有操作方便、快速準確和靈敏度較高的優點，適用于水中痕量苯胺和聯苯胺的快速測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC H-class超高壓液相色譜儀(美國Waters公司)，S220pH儀(上海梅特勒－托利多公司)，U-10電導率儀(日本Horiba公司)。苯胺(5.0 g/L，溶于甲醇)、聯苯胺(2.0 g/L，溶于二氯甲烷)均為美國AccuStandard公司產品;乙腈(色譜級，美國Tedia公司)，甲醇(色譜級，美國Kanglin公司)，醋酸銨(純度＞97.0%，美國Alfa Aesar公司)，實驗用水均為二次去離子水。針式過濾器(0.22 μm，13 mm內徑，材質分別為聚醚砜(PES)、尼龍(PA)和聚四氟乙烯(PTFE)，上海安譜公司)，針式過濾器(0.2 μm，13 mm內徑，材質為聚丙烯(GHP)，美國Waters公司)。

1.2 實驗步驟

取1 mL水樣，經針式過濾器過濾，收集到樣品瓶中，待液相色譜分析。水樣的pH值和電導率分別采用“1.1”所列pH儀和電導率儀測定。

1.3 實驗條件

針式過濾器為聚四氟乙烯材質;色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動相為乙腈－3.85 g/L醋酸銨(25∶75);流速0.7 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40℃;熒光檢測器的激發和發射波長:苯胺為λex/λem=232 nm/329 nm，聯苯胺為λex/λem=292 nm/383 nm。

2 結果與討論

2.1 熒光檢測條件的選擇

采用液相色譜熒光檢測器的光譜掃描技術，分別對苯胺和聯苯胺標準溶液的激發光譜和發射光譜進行掃描。通過對光譜圖進行分析，得到苯胺的發射波長為329 nm，激發波長在232 nm和292 nm各有1峰，其中232 nm處的激發能量最大;聯苯胺的發射波長為383 nm，激發波長僅在292 nm有1峰。最終確定苯胺和聯苯胺的激發/發射波長分別為232 nm/329 nm和292 nm/383 nm。

2.2 流動相條件的選擇

分別選擇甲醇－水、乙腈－水和乙腈－醋酸銨體系作為流動相，考察不同濃度有機相條件下，苯胺和聯苯胺的分離效果。為減少苯胺和聯苯胺的分析時間，結合儀器的最高耐壓限制，選擇流速為0.7 mL/min。對于乙腈－水和甲醇－水的流動相體系，確定最佳的流動相比例分別為25%乙腈和30%甲醇。圖1比較了30%甲醇－70%水、25%乙腈－75%水和25%乙腈－75%醋酸銨的流動相條件下，苯胺和聯苯胺的分離情況。結果顯示，3種流動相條件下，苯胺和聯苯胺均在1 min內達到基線分離;后兩種乙腈流動相體系下，分析時間可縮短為0.8 min。對于聯苯胺，有機相為乙腈的兩種體系下，信號響應明顯高于甲醇體系;對于苯胺，信號響應則略有提高。比較兩種乙腈體系，對于聯苯胺，25%乙腈－75%醋酸銨體系下的信號略高于25%乙腈－75%水體系，而對于苯胺，兩種體系相差無幾。

綜上，乙腈作為流動相可以縮短分析時間，并且顯著提高苯胺和聯苯胺的熒光信號，因此本研究優先選擇乙腈作為流動相中的有機相。由于采用直接進樣法，未進行樣品前處理，且苯胺和聯苯胺是弱堿性物質，水樣的pH值、電導率等因素很可能會影響苯胺和聯苯胺熒光信號，所以需對兩種乙腈流動相體系(25%乙腈－75%水和25%乙腈－75%醋酸銨)做進一步研究。

圖1 不同流動相條件下苯胺和聯苯胺的色譜圖Fig.1 Chromatograms of aniline and benzidine obtained by using different mobile phases

2.3 水樣pH值的影響

為了考察水樣pH值對分析結果的影響，采用自來水(未檢出苯胺和聯苯胺)配制了質量濃度均為50 μg/L的水樣。考察了25%乙腈－75%水(A)和25%乙腈－75%醋酸銨(B)的流動相體系下，不同水樣pH值對苯胺和聯苯胺回收率的影響(見圖2)。從圖2A可見，對于25%乙腈－75%水流動相體系，苯胺在pH 3.9～11.9的回收率為95%～104%;聯苯胺在pH 3.9～10.0時的回收率為92%～100%，但在pH 11.1和pH 11.9時，其回收率分別達到144%和169%。從圖2B可以得出，對于25%乙腈－75%醋酸銨流動相體系，在pH 3.9～11.9范圍內，苯胺和聯苯胺的回收率較高且穩定，分別在95%～103%和94%～100%之間。

由于苯胺和聯苯胺的pKa值分別約為4.6［21］和4.3［22］，在不同pH值的水溶液中，兩種物質可分別以兩種狀態存在:分子狀態和帶正電荷的離子狀態。對于苯胺，不同pH值的水樣中，兩種狀態的熒光信號幾乎無差別。而對于聯苯胺，當水樣pH值增加到一定數值后，相應的熒光信號不穩定，導致分析結果不穩定。通過在流動相中加入醋酸銨緩沖液，使聯苯胺主要以離子狀態穩定存在，克服由于水樣pH值變化而引起熒光信號變化的問題，增強其熒光信號的穩定性，提高分析測試的可靠性和準確性。圖2顯示25%乙腈－75%醋酸銨的流動相具有良好的緩沖能力，對于一般的環境樣品前處理，可不調pH值，以避免對苯胺和聯苯胺的濃度產生影響，保證分析的準確度和重現性。

圖2 不同pH值對苯胺和聯苯胺回收率的影響Fig.2 Effect of different pH values on recoveries of aniline and benzidine mobile phase:A.25%acetonitrile －75%H2O，B.25%acetonitrile－75%ammonium acetate

2.4 水樣電導率的影響

為了考察水樣電導率對分析結果的影響，采用不同稀釋倍數的自來水，配制了電導率不同但質量濃度均為100 μg/L的水樣。25%乙腈－75%水(A)和25%乙腈－75%醋酸銨(B)的流動相體系下，水樣不同電導率對苯胺和聯苯胺回收率的影響見圖3。從圖3A可以得出，對于25%乙腈－75%水的流動相體系，在不同電導率條件下，苯胺具有良好的回收率(95%～103%);而對于聯苯胺，隨著電導率的增加，其回收率逐漸增加，電導率為0.315 mS/cm后，回收率穩定在97%～101%之間。從圖3B可以得出，對于25%乙腈－75%醋酸銨的流動相體系，在不同電導率條件下，苯胺和聯苯胺均具有良好的回收率，分別在100%～104%和99%～102%之間。這說明25%乙腈－75%醋酸銨具有較寬的電導率耐受范圍，對于一般的環境樣品前處理，水樣的電導率對分析結果幾乎無影響。因此，實驗最終選用25%乙腈－75%醋酸銨為最佳流動相。

圖3 不同電導率值對苯胺和聯苯胺回收率的影響Fig.3 Effect of different conductivity values on recoveries of aniline and benzidine mobile phase:A.25%acetonitrile－75%H2O，B.25%acetonitrile－75%ammonium acetate

2.5 前處理方法的選擇

用自來水和一定體積甲醇或乙腈配制100 μg/L的苯胺和聯苯胺混合溶液，考察不同前處理方法的回收率。比較了4種膜材質(PES、PA、PTFE和GHP膜)針式過濾器過濾、5種溶劑(水、10%乙腈、20%乙腈、10%甲醇和20%甲醇)的效果，結果如圖4所示。圖4A顯示，對于苯胺，3種膜材質(PA、PTFE和GHP膜)過濾器在5種溶劑下的回收率均較高，在90%～104%之間，能滿足分析要求;而PES濾膜在含有機相的溶劑下的回收率異常升高，可能是由于溶劑中的有機成分(乙腈或甲醇)將PES膜上的一些組成物質溶解，該類物質對苯胺的熒光信號具有顯著增強效應。圖4B顯示，對于聯苯胺，2種膜材質(PA和PTFE膜)過濾器在5種溶劑下的回收率較高，在101%～116%之間，能滿足分析要求;其余2種膜材質(PES和GHP膜)在5種溶劑下的回收率偏低，可能是由于膜上的吸附作用降低了聯苯胺的回收率。另外，實驗中發現PA膜過濾器有時會析出熒光雜質，對分析結果存在一定干擾。綜合考慮，選擇不向水樣中加入任何有機溶劑，采用PTFE膜過濾器直接進行水樣過濾。

圖4 采用4種膜材質過濾器和5種溶劑進行前處理時苯胺(A)和聯苯胺(B)(濃度均為100 μg/L)的回收率Fig.4 Recoveries of added 100 μg/L aniline(A)and 100 μg/L benzidine(B)with four types of filters and five kinds of solvents in the pretreatment

2.6 標準曲線、靈敏度及精密度

以自來水(未檢出苯胺和聯苯胺)配制6個不同質量濃度(1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L)的苯胺和聯苯胺混合標準溶液，將熒光信號(峰面積)和質量濃度進行線性回歸分析，得到標準曲線和線性系數(見表1)。結果表明，苯胺和聯苯胺在1.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，線性系數(r)達到0.999以上。對10.0 μg/L的混合標準溶液，在相同條件下連續分析10次，苯胺和聯苯胺峰面積的RSD分別為0.4%和0.5%，滿足儀器精密度要求。

配制0.2 μg/L的混合標準溶液，按照本方法進行前處理和分析，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限和定量下限。由表1可見，苯胺和聯苯胺的檢出限分別為0.023、0.024 μg/L，定量下限分別為0.078、0.079 μg/L，均低于GB 3838－2002規定的控制標準值，因此本方法可滿足水質監測的分析要求。

表1 苯胺和聯苯胺的標準曲線、線性系數、線性范圍、檢出限及定量下限Table 1 Standard curves，correlation coefficients(r)，linear ranges，detection limits and quantitative limits of aniline and benzidine

2.7 方法的加標回收率

采用某飲用水水源地(未檢出苯胺和聯苯胺)的水樣分別配制不同濃度的苯胺和聯苯胺溶液，考察實際水樣中方法的加標回收率。苯胺和聯苯胺的加標濃度、實測值和回收率如表2所示。由表2可見，4種加標濃度下，苯胺和聯苯胺的回收率在86%～106%之間，說明方法有較好的回收率，可滿足分析檢測的要求。

表2 水樣中苯胺和聯苯胺的分析結果和回收率Table 2 Analysis results and recovery rate of aniline and benzidine in water

2.8 方法的優越性與局限性

本方法無需繁瑣的前處理過程，即取得較高的靈敏度，而且分析時間僅為0.8 min，可顯著提高工作效率。與其他方法比較(如表3所示)，本方法具有較明顯的優勢，如:NEAP法只能測定苯胺類化合物的總量，不能對單個苯胺類化合物進行定性和定量分析;HPLC/UV、HPLC/EC、GC－MS和SFC－UV方法由于儀器靈敏度較低，均需對水樣進行繁瑣的富集濃縮過程。ECIQ法可直接檢測水樣，但其對聯苯胺的檢測靈敏度不能滿足水質分析要求。電極法、EC、CE、RLS和SERS可直接分析水中的苯胺或聯苯胺，且靈敏度較高，但由于對應的儀器方法并不常見，在水質分析部門的普及率較低，不利于方法推廣與使用。與常規HPLC/FD相比，本方法擴展至聯苯胺的分析，顯著提高了靈敏度，而且流速低，可減少流動相的消耗。本方法的局限性在于:雖然苯胺類物質熒光信號的選擇性和超高壓液相色譜的強大分離能力，在較大程度上可將分析物和雜質分離，但僅靠保留時間定性，仍可能出現假陽性結果，此時需要采用不同色譜柱進一步加以確認。

表3 水中苯胺和聯苯胺的分析方法比較Table 3 Comparison of various analysis methods of aniline and benzidine in water

(續表3)

2.9 實際水樣分析

采集某飲用水水源地、引水渠、淡水湖和咸水湖的水樣，4個水樣的pH值在7.7～8.9之間，除咸水湖水樣的電導率較高(達18.1 mS/cm)外，其余水樣的電導在0.324～0.477 mS/cm之間。按照本方法對4個水樣進行分析，同時加入低濃度混合標準溶液(2.0 μg/L)進行加標分析。結果顯示，4種不同類型水樣中均未檢出苯胺和聯苯胺，對應的低濃度加標回收率較高，分別為苯胺88%～107%，聯苯胺:90%～99%(見表4)。結果表明，本方法適用于多種類型地表水體中苯胺和聯苯胺的快速檢測。

表4 4種水樣的pH值、電導率以及在加標濃度為2.0 μg/L下苯胺和聯苯胺的回收率Table 4 pH values，conductivity values and recoveries(spiked 2.0 μg/L)of aniline and benzidine in four kinds of water samples

3 結論

采用直接進樣/超高壓液相色譜熒光檢測法，成功地進行了多種類型地表水體中苯胺和聯苯胺的快速分析。該方法與已報道的方法相比，無需繁瑣的前處理濃縮過程，具有操作簡單、方法檢出限低、分析速度快等優點，滿足水質監測的需求。有望用于分析其他具有熒光信號的芳香胺類物質。

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