正交設(shè)計(jì)－重復(fù)試驗(yàn)法優(yōu)選蒙藥沙棘清喉顆粒的提取工藝

楊萬(wàn)政 蒲維維 白音夫

(1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081 2.中國(guó)氣象局北京城市氣象研究所，北京 100089 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

蒙藥沙棘清喉顆粒由金銀花、牛蒡子、玄參、沙棘等7味中藥組成，具有清透熱邪、利咽散結(jié)之功效。根據(jù)處方藥味性質(zhì)及藥理作用的研究，本文選用綠原酸、牛蒡子苷和總黃酮作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)清喉顆粒的提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。藥理實(shí)驗(yàn)表明，綠原酸具有利膽保肝、抗菌、抗病毒、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用［1－3］;牛蒡子苷具有鈣拮抗樣作用，能抗腎炎，改善血清生化指標(biāo)和抗腫瘤作用以及擴(kuò)張血管等作用［4］;沙棘總黃酮(THF)能增強(qiáng)小鼠特異和非特異免疫功能，提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗?jié)儭⒖寡住⒖惯^(guò)敏、抗氧化、抗衰老、抗輻射和抗菌、抗病毒及增強(qiáng)免疫等廣泛的藥理功效［5］。

本文采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)沙棘清喉顆粒的制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，同時(shí)由于正交表中各列因素水平均已排滿，不需使用更大的正交表。故作重復(fù)試驗(yàn)，估算試驗(yàn)誤差，進(jìn)行方差分析，以此確定各因素的顯著性水平。從而得出清喉顆粒的最佳工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器:LC10－ADvp型高效液相色譜儀;V－550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);Millipore純水機(jī);Adventurer電子分析天平。

1.2 藥材:金銀花、薄荷、牛蒡子、玄參、蘆根購(gòu)于北京同仁堂藥店;沙棘購(gòu)于水利部高原圣果有限公司;余甘子購(gòu)于西藏藥廠。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品:綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110753－200413)、牛蒡子苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110819－200404)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(100080－200306)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.4 試劑:甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 提取工藝篩選:按處方比例，稱取各藥味，加溶劑浸泡，提取工藝篩選得到樣品溶液。以L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)。考察因素見(jiàn)表1。

綜合評(píng)分:因金銀花為方中君藥，綠原酸為金銀花的主要有效成分，具有較高的藥理活性，故綠原酸為重要指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)定為0.4。牛蒡子苷為牛蒡子的有效成分，且牛蒡子為方中臣藥，因此，牛蒡子苷作為評(píng)價(jià)提取工藝的一個(gè)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.3。作為大類成分間接控制的一個(gè)指標(biāo)，總黃酮的權(quán)重系數(shù)定為0.3。

表1 因素與水平

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 綠原酸的含量測(cè)定:色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;檢測(cè)波長(zhǎng)327nm;流動(dòng)相乙腈－水(20:80)，磷酸調(diào)節(jié)pH=4;流速1mL/min;柱溫30℃。

分別準(zhǔn)確移取濃度為8.5μg·mL－1的綠原酸對(duì)照品溶液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=54645x－122210，R2=0.9997。結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣濃度在8.5～68μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，過(guò)微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μl進(jìn)樣測(cè)定峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中綠原酸的含量。

2.2.2 牛蒡子苷的含量測(cè)定:色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相乙腈－水(30:70);流速1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)278nm;柱溫30℃。

分別準(zhǔn)確移取濃度為 8.7μg·mL－1對(duì)照品溶液 0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=11918x－2845.6，R2=0.9996。結(jié)果表明牛蒡子苷進(jìn)樣濃度在2.175～69.600μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，過(guò)微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.2.3 總黃酮的含量測(cè)定:精確稱取6.1mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，備用。分別準(zhǔn)確移取以上述對(duì)照品溶液 5mL、7mL、9mL、11mL、13mL、15mL 于25mL容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置10min。

以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。結(jié)果表明總黃酮濃度在 4.880 ～14.640μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

取1mL樣品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，靜置10min，進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品含量。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果:根據(jù)以上正交因素的因素－水平表，按四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.3.2 結(jié)果分析:為避免實(shí)驗(yàn)誤差的干擾，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了極差分析。結(jié)果見(jiàn)表。因?yàn)闃O差R的大小顯示影響因素的主次，由R值大小可見(jiàn)，不同因素對(duì)有效成分提取量的影響程度不同，表2表明影響因素順序?yàn)镈(提取次數(shù))＞A(乙醇濃度)＞C(提取時(shí)間)＞B(料液比)。

提取次數(shù)對(duì)有效成分得率影響最大，提取次數(shù)為3次時(shí)提取效果最好;提取時(shí)間的影響次之，提取時(shí)間為1.5h時(shí)，有效成分得率最高;乙醇濃度則以70%為最佳;料液比對(duì)提取的影響最小，從極差分析可以看出，料液比達(dá)到1:10，有效成分得率較其它條件時(shí)要高。所以在生產(chǎn)時(shí)可以采用 A2B2C2D3，即工藝條件為:70%乙醇、浸泡 2h、1:10、1.5h/次，共提取3次。

2.4 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn):為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝條件的穩(wěn)定性，按最佳工藝條件A2B2C2D3進(jìn)行重復(fù)2次提取，對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷得率的RSD值均小于3%，從而說(shuō)明該工藝合理可行。

表4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

復(fù)方提取工藝考察了醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素，選取了有顯著影響的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響程度為:提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。

最佳復(fù)方提取工藝為:藥材飲片先粉碎成粗粉，加入10倍量70%乙醇進(jìn)行提取，每次提取1.5h，共提取3次。在該條件下各指標(biāo)含量較高，說(shuō)明藥材提取利用較完全，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，該工藝穩(wěn)定可行。

［1］劉軍海，裘愛(ài)泳.杜仲葉綠原酸提取純化工藝的研究［J］.中藥材，2004，12

［2］陰鍵編.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用(2)［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1995:66

［3］Abraham S K，Sarma L，Kesavan P C.Protective effects of chlorogenic acid，curumin and a a－carotene against r－radiation － induced in vivo chromosomal damage［J］.Mutation Research，1993，303:109 ～112

［4］王本祥.現(xiàn)代中藥藥理與臨床［M］.天津:天津科技翻譯出版社，2004

［5］黃朗，劉常伍，范維衡等.醋柳總黃酮防治冠心病藥理基礎(chǔ)研究［J］.華西藥學(xué)雜志，1986，1(3):163～167