S100A6通過PI3K/Akt信號通路促進人骨肉瘤細胞143B增殖和遷移*

王海燕， 鄒正渝， 段 亮， 陳 嫻， 李 歡， 袁世梅， 何通川， 周 蘭

(重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶400016)

骨肉瘤是最常見的原發性惡性腫瘤之一，發病年齡多在15～25歲之間，惡性程度較高，極易出現轉移，預后極差，其發病原因和發病機制尚未完全清楚。目前骨肉瘤的治療采取以手術為主的綜合治療，截肢后3～5年的存活率僅為5% ～20%左右。因此，研究骨肉瘤的發病機制，為臨床早期診斷、治療以及預后提供可靠依據。

S100A6屬于S100蛋白家族成員，分子量約為10 kD，能與游離鈣離子或者靶蛋白結合后發揮多種生物學作用，如參與細胞的增殖與凋亡、調節酶活性、維持胞內鈣穩態，蛋白質的磷酸化等。大量文獻報道其在骨肉瘤［1］、胃癌［2］等腫瘤組織中表達異常，其作用機制尚未完全明確。本課題組前期成功制備了有活性的重組人S100A6蛋白(recombinant human S100A6，rhS100A6)，外 源 性 地 加 入 30 mg/L rhS100A6能夠顯著增強人骨肉瘤細胞143B的增殖、遷移及侵襲能力，并且明顯上調143B細胞中β-catenin的水平，而對143B細胞的凋亡沒有明顯影響［3］。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號途徑是近年來發現的一條重要的細胞信號轉導途徑，參與細胞生長、增殖、分化等多個過程，在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用。LY294002和wortmannin是PI3K抑制劑，可以通透細胞特異性阻斷PI3K/Akt信號通路，抑制Akt磷酸化。S100A6對143B細胞是否可以通過調節PI3K/Akt信號途徑發揮作用，目前尚未報道。本課題聯合rhS100A6與PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細胞，旨在探討PI3K/Akt信號途徑在S100A6誘導的143B細胞的增殖和遷移中的作用。

材料和方法

1 細胞與試劑

人骨肉瘤細胞143B由美國芝加哥大學醫學中心分子腫瘤研究室饋贈。DMEM培養基、胎牛血清購自HyClone。重組質粒 pGST-HRV3C、pGST-ClvHRV3C-hS100A6和感受態細菌E．coli BL21為本實驗室保存。LY294002購自CST。Wortmannin購自Sigma。鼠抗人S100A6單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz。兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-Akt(Ser473)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購自CST。化學發光試劑盒購自Pierce。PVDF膜和Millicell細胞培養小室購自Millipore。MTT購自Sigma。結晶紫購自溫州東升化工公司。

2 方法

2．1 rhS100A6的制備 rhS100A6制備的方法參考文獻［3］。分別將重組質粒 pGST-HRV3C和 pGSTClvHRV3C-hS100A6轉化至感受態細菌E．coli BL21中，在LB培養基中培養擴增，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達蛋白，分別表達重組蛋白谷胱甘肽S轉移酶－人鼻病毒3C蛋白酶(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease，GST-HRV3C)和重組蛋白谷胱甘肽S轉移酶－人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease cleavage site-hS100A6，GST-ClvHRV3C-hS100A6)，超聲破菌后，谷胱甘肽－瓊脂糖4B球珠(glutathione sepharose 4B，GS4B)純化，GST-HRV3C酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6，經GS4B純化，即為rhS100A6蛋白，行SDS-PAGE(考馬斯亮藍染色)和Western blotting鑒定，－20℃保存備用。

2．2 細胞培養和分組 人骨肉瘤細胞143B培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，實驗分組為:空白組、rhS100A6(30 mg/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+LY294002(10 μmol/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+wortmannin(0.5 μmol/L)組、LY294002(10 μmol/L)組和wortmannin(0.5μmol/L)組。

2．3 Western blotting檢測細胞中 t-Akt和 p-Akt的蛋白水平 取對數生長期細胞，待細胞融合度達到50%左右時更換為1%胎牛血清DMEM培養基，進行實驗干預，分組同上，于37℃、5%CO2培養箱中培養，此時記為0 h。48 h后加入細胞裂解液后提取細胞總蛋白，分光光度儀測定其濃度。蛋白煮沸變性，經10%SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜，5%BSA封閉2 h，加Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，0.1%TBST洗滌，加Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)37℃ 孵育1 h，0.1%TBST洗滌，按照電化學發光試劑盒說明對其顯色，用凝膠成像儀與Quantity One軟件采集圖像，并對其分析。

2．4 MTT檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，用DMEM完全培養基稀釋至約1×107cells/L，于96孔板中每孔接種200μL，于37℃、5%CO2培養箱培養。12 h后更換為1%胎牛血清DMEM培養基，進行實驗干預，分組同上，均設5個復孔，此時記為0 h。于1～4 d后每孔內加入20μL MTT，繼續孵育4 h，棄上清，每孔加200μL DMSO，測492 nm處吸光度值，以均值為縱坐標，時間為橫坐標，描繪細胞生長曲線。

2．5 Transwell檢測細胞遷移 取對數生長期細胞，用無血清 DMEM培養基稀釋至1×108cells/L，取400μL加入到Transwell上室內，下室加入600μL 20%胎牛血清DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養，此時記為0 h。24 h后將小室取出，PBS洗凈，置于無水乙醇中固定20 min，于結晶紫中染色20 min，PBS洗凈，待小室風干，倒置顯微鏡下觀察并對各組穿膜細胞進行計數。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗比較兩組間差異的顯著性，用SPSS 16.0軟件包分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 制備的rhS100A6通過鑒定并具有促進143B細胞增殖和遷移的活性

將rhS100A6經SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色，Western blotting加以鑒定，結果顯示，制備的rhS100A6分子量正確，見圖1A;相比PBS陰性對照組，制備的rhS100A6蛋白能與鼠抗人S100A6單克隆抗體發生特異反應，見圖1B;證實rhS100A6蛋白成功制備。

Figure 1．Identification of rhS100A6．A:SDS-PAGE;B:Western blotting．圖1 rhS100A6的鑒定

隨之，30 mg/L rhS100A6處理143B細胞特定時間后，MTT增殖實驗和 Transwell遷移實驗顯示rhS100A6顯著增強143B細胞的增殖(見圖4 rhS100A6 group)和遷移能力(見圖 5 rhS100A6 group)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2 rhS100A6促進143B細胞中Akt的磷酸化

30 mg/L rhS100A6作用143B細胞48 h后，Western blotting結果顯示，空白組p-Akt的校正灰度值為0.35±0.03，rhS100A6組p-Akt的校正灰度值為0.67±0.02，rhS100A6組較空白組增加91.4%(P＜0.05)，而兩組的t-Akt校正灰度值之間則無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。結果提示rhS100A6能夠促進Akt的磷酸化，即激活PI3K/Akt信號通路。

3 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6誘導的143B細胞中磷酸化Akt的上調

聯合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細胞48 h后，Western blotting結果顯示，空白組 p-Akt的校正灰度值為0.38±0.02，rhS100A6組 p-Akt的校正灰度值為 0.96±0.05，rhS100A6組較空白組增加 263.1%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002聯合處理組p-Akt的校正灰度值為0.56±0.03，較rhS100A6組減少44.7%(P＜0.05);而rhS100A6+wortmannin聯合處理組的校正灰度值為 0.45±0.03，較 rhS100A6組減少53.1%(P＜0.05)，見圖3。結果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6誘導的143B細胞中磷酸化Akt的上調。

4 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6對143B細胞的促增殖作用

聯合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細胞1～4 d后，MTT結果顯示，在處理1～4 d后空白組的A492值分別為0.256±0.033、0.303±0.059、0.326±0.084和 0.318±0.061，rhS100A6組的 A492值分別為0.288±0.025、0.467±0.035、0.589±0.068和 0.623±0.031，rhS100A6組較空白組分別增加12.5%、54.1%、80.7%和95.9%(P＜0.05);而rhS100A6+LY294002聯合處理組的A492值分別為0.284±0.042、0.402±0.073、0.461±0.031和 0.474±0.026，較 rhS100A6組分別減少10.3%、23.9%、31.7%和58.4%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin聯合處理組的A492值分別為0.267±0.042、0.356±0.073、0.393±0.031和0.414±0.026，較rhS100A6組分別減少17.2%、28.3%、44.5%和69.7%(P＜0.05)，見圖4。結果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6對143B細胞的促增殖作用。

5 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6對143B細胞的促遷移作用

聯合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細胞24 h后，Transwell遷移結果顯示，空白組穿過的細胞數為32±3，rhS100A6組穿過的細胞數為86±4，rhS100A6組較空白組增加168.8%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002聯合處理組穿過的細胞數為57±5，較rhS100A6組減少37.9%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin聯合處理組穿過的細胞數為52±4，較 rhS100A6組減少41.6%(P＜0.05)，見圖5。結果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉rhS100A6對143B細胞的促遷移作用。

Figure 3．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced phosphorylation of Akt in 143B cells detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖3 LY294002和wortmannin對rhS100A6誘導的143B細胞Akt磷酸化的影響

Figure 4．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced proliferation of 143B cells detected by MTT assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖4 LY294002和wortmannin對rhS100A6誘導的143B細胞增殖活性的影響

討 論

S100A6 由 Kuznicki等［4］首次在 Ehrlich 腹水瘤中發現，屬于S100鈣離子結合蛋白家族，具有EF手型結構，分子量約為10 kD。當它結合鈣離子后隨即發生蛋白構象的改變，使其經典的EF手型結構得以暴露，該EF手型結構可以與多種靶蛋白結合，如原肌球蛋白、CacyBP/SIP及某些膜連蛋白等［5］。Wei等［6］應用質譜分析在小鼠乳腺癌模型中發現血清中S100A6的量與腫瘤的發生發展呈正相關;Wang等［7］發現胃癌中S100A6的過度表達與病人的預后不良有關;Ilg等［8］在研究中發現在腫瘤邊緣多有S100A6的異常表達，提示其可能與腫瘤的生長、侵襲和遠處轉移關系密切;Luo等［9］發現人骨肉瘤組織中存在S100A6的過度表達，其作用尚存爭議。本課題組前期實驗結果表明S100A6能促進人骨肉瘤細胞系143B的增殖及遷移侵襲［3］，關于S100A6對人骨肉瘤的具體作用機制尚未報道。PI3K/Akt途徑是近年來發現的一條重要的細胞信號轉導途徑。研究表明，在多種腫瘤組織，如骨肉瘤［10］、胃腸道腫瘤［11］、乳腺癌和前列腺癌［12］等癌組織中均有Akt的過度表達及活化，Akt的活化能磷酸化多種下游靶分子，如Bcl-2家族、糖原合成酶激酶3(GSK3)和S6蛋白激酶等，對細胞的生存、凋亡和動力等有重要影響。Gao等［13］發現在卵巢癌細胞中通過激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K1信號通路可增加cyclins的表達，促進G1期發展，促進細胞增殖與分化。Grille等［14］發現AKT可通過誘導上皮間質轉化促進鱗狀癌細胞系的動力和侵襲;maseki等［15］發現Akt/GSK3β/snail信號通路可介導頭頸鱗狀癌細胞系的增殖與動力;龐瑞萍等［16］發現吲哚美辛可通過激活Akt/GSK3β/NAG-1信號通路誘導胃癌細胞的凋亡。在骨肉瘤治療方面，某些抗腫瘤藥物也可通過PI3K/Akt信號途徑抑制骨肉瘤的生長和發展，比如松弛素可通過PI3K/Akt/VEGF通路促進Saos-2細胞的生長、侵襲以及血管發生［17］，木黃酮可通過下調PI3K/Akt信號通路從而增強吉西他濱對骨肉瘤的抗癌效應［18］。上述研究提示PI3K/Akt信號通路的激活對骨肉瘤的發生發展具有重要的作用。

Figure 5．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced migration of 143B cells detected by Transwell assay．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖5 LY294002和wortmannin對rhS100A6誘導的143B細胞遷移活性的影響

基于上述研究，本研究擬探明S100A6對骨肉瘤的作用是否經由該途徑。結果表明，rhS100A6在顯著增強人骨肉瘤細胞143B的增殖和遷移能力的同時，也能夠上調Akt的磷酸化，提示PI3K/Akt信號通路的激活可能參與介導rhS100A6對143B細胞的促增殖和遷移作用。隨之，我們應用 PI3K抑制劑LY294002或wortmannin來驗證我們的假設，實驗結果與預期相符，即LY294002和wortmannin均在明顯逆轉rhS100A6誘導的143B細胞中Akt磷酸化的上調作用的同時，也逆轉其對143B細胞的促細胞增殖和遷移的作用。所以我們認為S100A6對人骨肉瘤細胞143B的促增殖與遷移作用至少部分是通過激活PI3K/Akt信號通路實現的。

綜上所述，本研究在一定程度上揭示了在S100A6介導的促人骨肉瘤細胞143B增殖及遷移的作用中PI3K/Akt信號通路的參與，為進一步闡明S100A6對骨肉瘤的作用及機制、甚至骨肉瘤的發生發展機制提供了實驗依據，也為骨肉瘤的治療研究提供了潛在的靶點。