上調miR-187* 表達對人結腸癌細胞株增殖活性的影響*

張麗靜， 劉 博， 趙增仁， 樊智彬， 田延鋒

(河北醫科大學第一醫院普外科，河北 石家莊050031)

近年來，我國結直腸癌的發病率逐年上升。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調控靶基因的表達，在細胞分化、細胞周期及凋亡過程中發揮重要作用［1］。本課題組早期利用miRNA 芯片篩查了結直腸癌組織和正常黏膜的miRNA 表達譜，發現miR-187* 是其中具有顯著差異性表達的miRNA 之一。為此，本研究通過實時定量PCR 驗證miR-187* 的表達結果，并通過轉染模擬物，觀察上調miR-187* 表達對結腸癌細胞增殖及細胞周期的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗對象

人結腸癌細胞株Caco-2、DLD1、HCT116、HT29、LoVo、SW480、SW620 和SW1116 由香港中文大學消化疾病研究所于君教授饋贈。收集河北醫科大第一醫院2010 年6 月至2012 年6 月間正常結腸黏膜組織10 例。新鮮組織切除后快速置于液氮后儲存于-80 ℃冰箱。

2 主要試劑

McCoys 5A 培養基、RPMI-1640 培養基和DMEM高糖培養基購自Gibco;胎牛血清購自HyClone;脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000 購自Invitrogen;miRNA 提取試劑盒和miR-187* 熒光定量PCR 檢測試劑盒購自Ambion;miR-187* 模擬物和陰性對照購自廣州銳博生物技術有限公司;MTS 細胞增殖檢測試劑盒購自Promega。

3 主要方法

3.1 miRNA 微陣列芯片檢測 選取3 例性別、年齡及臨床病理資料一致的結直腸癌患者，收集術中腫瘤組織及切緣正常黏膜組織標本，提取RNA 后，采用ParafloTMmiRNA 微陣列芯片分析，篩選出結直腸癌組織中異常表達的miRNAs。miRNA 探針序列信息來自于Sanger miRBase Release 17.0 版本數據庫，該芯片含有1 719 條成熟的人miRNAs 探針，此項工作由美國LC Sciences 公司完成。

3.2 細胞培養、細胞株及正常結腸組織中miR-187* 表達水平的檢測 DLD1 細胞、SW480、SW620 和SW1116 細胞培養于RPMI-1640 培養基中，HT29 和HCT116 細胞培養于McCoy's 5A 培養基中，LoVo 細胞培養于DMEM 培養基中，均添加10%胎牛血清。6 孔板細胞培養板隔天傳代擴增結腸癌細胞，待細胞狀態良好，近90%融合時，預冷PBS 沖洗細胞3 次終止培養，冰上刮棒刮取細胞移入離心管，離心后收集細胞備用。

取新鮮結腸組織100 mg，置于液氮預冷處理的研缽中，固化、研碎，備用提取RNA。按照miRNA 提取試劑盒說明，分別抽提8 株結腸癌細胞株及正常結腸新鮮組織中總miRNA。按照Ambion 公司的qRT-PCR miRNA 檢測試劑盒說明，首先對各個細胞系和新鮮組織總miRNA 進行逆轉錄，然后在實時定量PCR 儀上進行PCR 擴增，使用U6 作為內參照。

3.3 miR-187* 模擬物的轉染 將結腸癌細胞HCT116 細胞接種后24 h，待貼壁細胞達到40% ～50% 時進行轉染，參照脂質體轉染試劑說明書分別轉染miR-187* 模擬物和陰性對照(negative control，NC)。

3.4 細胞增殖活性的檢測 (1)轉染miR-187* 模擬物組和NC 組結腸癌HCT116 細胞株，于轉染后24 h ，消化細胞，分別接種于96 孔板。按照MTS 細胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96 孔板后12、24、36、48 和60 h 各檢測1 次。每組設5 個復孔，實驗重復3 次。(2)細胞轉染后24 h，收集提取2 組細胞中RNA，進行反轉錄，檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)mRNA 的變化。PCNA 及GAPDH 引物由北京賽百盛生物公司合成。PCNA 上游引物5'-CTTTTCTGTCACCAAATTTGTACC-3'，下游引物5'-AACTGCATTTAGAGTCAAGACCC-3';GAPDH上游引物5'-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3'，下游引物5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACG-3'。結果用2-ΔCt法計算，ΔCt =目的基因平均Ct 值-內參照基因平均Ct 值。

3.5 流式細胞術檢測細胞周期 轉染miR-187* 模擬物組和NC 組結腸癌HCT116 細胞株，于轉染后48 h，消化收集細胞樣品，制成單細胞懸液，然后1 200 r/min 離心5 min，棄上清液。用4 ℃預冷的70%冷乙醇固定，4 ℃保存，固定18 h。調整細胞濃度為1 ×109cells/L，取1 mL 細胞懸液，用PBS 洗3 次，細胞重懸于1 mL PI 染液中，室溫避光孵育30 min 后，流式細胞儀測熒光強度，PI 染液終濃度為50 mg/L，RNase 終濃度為10 mg/L。CellQuest 分析軟件進行細胞周期DNA 含量分析，確定細胞周期分布。

3.6 miR-187* 的靶基因預測及表達情況 檢索miRDB、DIANA-microT 和microRNA. org 等數據庫，取多個數據庫預測靶基因的交集，發現miR-187* 可能的靶基因有TBX22、B 細胞特異性莫洛尼小鼠白血病病毒整合位點1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1，BMI-1)、CDH2、MYB、RB1、FZD3 等。查閱相關文獻后，我們初步選定BMI-1 為可能的靶基因。隨后我們檢測了BMI-1 mRNA 在人結腸癌細胞株及正常結腸組織中的表達情況。BMI-1 上游引物為5'-GTGCTTTGTGGAGGGTACTTCAT-3 '，下 游 引 物 為 5 '-TTGGACATCACAAATAGGACAATACTT-3'，以GAPDH 作為內參照。細胞轉染后24 h，收集細胞，Trizol 法提取細胞中的總RNA。采用熒光定量RT-PCR 方法檢測各轉染組細胞中BMI-1 mRNA 的表達，結果用2-ΔCt法計算。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0 統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較用t 檢驗，多組數據之間的差異采用單因素方差分析。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 結腸癌細胞株中miR-187* 的表達

本課題組前期使用miRNA 芯片檢測了3 對結直腸癌組織及匹配的遠端正常黏膜組織中的miRNA表達譜，發現miR-187* 在結直腸癌組織中的表達較正常結直腸黏膜組織明顯下調，見圖1。本實驗中我們檢測了8 種結腸癌細胞株中miR-187* 的表達，如圖2 所示，在結腸癌細胞株中miR-187* 的表達較正常結直腸黏膜組織明顯下調，與組織芯片結果一致。

Figure 1. miRNA array results. T1，T2，T3:the primary tumor tissues from three cases of colorectal cancer patients;N1，N2，N3:the matched normal mucosal tissues.圖1 miRNA 芯片結果

Figure 2. miR-187* expression in eight colon cancer cell lines and the normal colon tissues. Mean ± SD. n = 3.＊＊P ＜0.01 vs colon cancer cell lines.圖2 結腸癌細胞株及正常結腸黏膜組織中miR-187* 的表達

2 miR-187* 對結腸癌細胞HCT116 增殖活性的影響

將HCT116 細胞分別轉染miR-187 模擬物和陰性對照，檢測miR-187* 的表達，結果顯示，轉染miR-187* 模擬物組，miR-187* 的表達水平明顯升高，約是NC 組的1 000 倍，見圖3A。隨后使用MTS法檢測這2 組細胞在不同時點的增殖活性，結果發現轉染miR-187* 模擬物組與NC 組相比，各個時點細胞的增殖活力顯著降低(P ＜0.01)，見圖3B。同時轉染miR-187* 模擬物組，PCNA mRNA 的表達亦明顯降低(P ＜0.05)，見圖3C。

3 miR-187* 對結腸癌細胞HCT116 細胞周期的影響

對轉染48 h 后的細胞進行細胞周期分析，與NC對照組相比，轉染miR-187 模擬物后，G2/M 期的細胞比例明顯增加，見圖4。

4 結腸癌細胞株中BMI-1 mRNA 的表達

采用熒光定量RT-PCR 檢測8 種結腸癌細胞株和正常結直腸黏膜組織中BMI-1 mRNA 的表達情況，發現結腸癌細胞株中BMI-1 mRNA 的表達較正常結直腸黏膜組織表達明顯增高，見圖5。

5 轉染miR-187* 抑制BMI-1 mRNA 表達

瞬時轉染HCT116 細胞，應用實時熒光定量PCR 檢測轉染后實驗組及對照組HCT116 細胞中BMI-1 mRNA 的表達水平，結果表明，miR-187* 高表達導致BMI-1 mRNA 表達下調(P ＜0.01)，見圖6。

Figure 3. The effect of miR-187* on the proliferation of HCT116 cells.A:miR-187* expression after transfection with miR-187*mimics (n=3);B:MTS results(n=5);C:PCNA mRNA expression(n=3).Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs miR-187* mimics.圖3 miR-187* 對結腸癌細胞HCT116 增殖活性的影響

Figure 4. Cell cycle of HCT116 cells tested by flow cytometry. Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs NC.圖4 流式細胞術分析細胞周期

Figure 5. BMI-1 mRNA expression in human colon cancer cell lines and the normal mucosal tissues detected by realtime RT-PCR. Mean ± SD. n =3. * P ＜0. 05 vs normal.圖5 結腸癌細胞株中BMI-1 mRNA 的表達

討 論

miRNA 是一類長約19 ～24 nt 的單鏈非編碼RNA，它具有多種調控基因表達的功能。miRNA 主要通過特異性識別并結合靶mRNA 的3'-非翻譯區(untranslated region，UTR)，于轉錄后促進靶mRNA降解和(或)抑制翻譯過程而發揮作用［2］。miRNAs幾乎在所有細胞的生物學進程中發揮重要的調控作用，如細胞增殖、分化、代謝、凋亡和應激等。人類蛋白質編碼基因約1/3 受miRNA 的調控［3］。

研究表明，miRNA 在結直腸癌發生和發展過程中發揮了重要的作用。表達譜分析發現，結直腸癌中存在許多異常表達的miRNA，功能研究也發現不同的miRNA 在結直腸癌的進程中發揮著不同的作用:某些miRNA 通過靶向調節原癌基因起到抑制腫瘤的作用［4］，而某些miRNA 則通過靶向調節抑癌基因發揮促進結直腸癌發生發展的作用［5］。例如:miR-143 通過直接抑制K-ras 癌基因的表達而抑制結直腸癌細胞增殖［6］;miR-195 通過調節Bcl-2 的表達，抑制結直腸癌細胞凋亡［7］;miR-137 通過調節FMNL2 表達調控結直腸癌細胞的浸潤和轉移［8］。

為了探討miRNA 參與結腸癌發生發展的分子機制，本研究前期通過miRNA 芯片技術篩選出大量差異性表達的miRNA，其中miR-187* 在結直腸癌組織中表達明顯下調。miR-187* (miR-187-5p)是miR-187 家族的一員，位于18 號染色體上［9］。目前關于miR-187 在腫瘤中的作用尚存在一定的爭議，有學者研究證實，卵巢癌中miR-187 呈高表達［10］，乳腺癌中miR-187 的高表達和患者的不良預后有關［11］，然而前列腺癌和胰腺癌細胞中miR-187 低表達［12-13］。

目前關于miR-187* 在腫瘤中的研究罕有報道。Liu 等［14］發現miR-187* 在胃癌患者中表達水平明顯升高，Ho 等［15］研究證實，毛細胞型星形細胞瘤標本中miR-187* 的表達水平明顯低于正常組織。然而未見在結直腸癌組織中的相關研究。為了驗證前期芯片中miR-187* 表達的結果，本研究通過實時熒光定量PCR 技術再次檢測了8 種結腸癌細胞株中miR-187* 的 表 達 狀 況，結 果 發現，結腸癌細胞株中miR-187* 的表達較正常結腸組織顯著降低，與miRNA 芯片結果一致，表明miR-187* 的表達下調可能與結直腸癌發展有關。

為了深入了解miR-187* 在結腸癌發病過程中的具體作用及其對結腸癌細胞生物學行為的影響，本研究使用化學合成的miR-187* 模擬物轉染結腸癌HCT116 細胞，上調結腸癌HCT116 細胞中miR-187* 的表達，采用MTS 與流式細胞技術檢測細胞周期，測定細胞增殖活性，發現miR-187* 模擬物轉染結腸癌細胞后，明顯抑制該細胞增殖速度，抑制效應持續48 h 以上;且轉染miR-187* 模擬物組PCNA mRNA 表達也明顯下降。miR-187* 模擬物轉染組中G2/M 期細胞明顯增多，提示轉染miR-187*模擬物后，可致HCT116 細胞周期發生改變。miR-187* 可能是通過將細胞周期阻滯在G2期，延長細胞增殖周期而起到抑制細胞增殖的作用。

細胞增殖過程有諸多蛋白參與，推測miR-187*可能直接或間接錨定其中某些蛋白mRNA 3'-UTR區，使蛋白合成抑制或減少，使細胞周期與細胞增殖活性失調而發生惡性轉化。卵巢癌中的一項研究表明，miR-187 通過調控抑癌基因Dab2 促進細胞增殖［10］。本課題組通過對多種miRNA 靶標數據庫進行預測，發現BMI-1 可能是miR-187* 的下游靶點。BMI-1 是多梳家族成員之一，通過調控組蛋白乙酰化或去乙酰化修飾過程，影響細胞增殖、凋亡過程［16-17］。研究證實，BMI-1 在多種腫瘤中高表達，包括胃癌、結腸癌、乳腺癌等。蔣麗麗等［18］研究發現，BMI-1 在膠質瘤的發生發展過程中起到重要作用，抑制BMI-1 表達可以抑制膠質瘤細胞的增殖及血管增生能力。本實驗中，我們轉染miR-187* 模擬物之后，miR-187* 的表達明顯增加，同時發現，miR-187* 的高表達顯著抑制了BMI-1 的轉錄。因此我們推測miR-187* 可能通過調控BMI-1 而發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。但其具體作用機制尚待進一步研究。

綜上所述，miR-187* 高表達能夠抑制結腸癌細胞增殖活性，影響細胞周期，在結腸癌發生發展中起重要作用。BMI-1 可能為miR-187* 的作用靶點，深入探討二者的相互關系可為闡明miR-187* 的抑癌機制提供新的思路。

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