磷酸化MEK2(Thr394)在結直腸癌中的表達及其臨床意義*

彭 慧， 王道海， 胡 英， 王 磊， 黃美近， 劉煥亮， 汪建平△

(1中山大學附屬第六醫院結直腸外科，2中山大學胃腸病研究所，廣東廣州510655;

3河南省腫瘤醫院普外科，河南鄭州450008;4中山大學附屬第一醫院特診中心，廣東廣州510080)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的形成和發展是一個多因素多階段的復雜病理過程，其涉及到腸上皮細胞的增殖、分化、凋亡、逃避反應機制，而這些機制均由細胞內外的信號轉導途徑所調控。信號轉導途徑的異常往往導致細胞增殖和凋亡失控，與結直腸癌的發生密切相關［1-2］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activaited protein kinase，MAPK)通路是細胞信號轉導的重要途徑，可以將多種細胞外信號通過磷酸化活化逐級傳遞至細胞內，參與細胞生長、分裂、分化及凋亡等多種生理過程，并在細胞惡性轉化中起重要作用［3-6］。MAPK信號轉導途徑中的關鍵調節因子——絲裂原細胞外激酶1/2(mitogen extracellular kinase 1/2，MEK1/2)可被多種炎癥因子、生長因子和環境應激反應等通過磷酸化而激活，從而產生不同的生物學效應。研究發現MEK1/2的多個磷酸化位點的生物學效應與結直腸癌的發生相關［5-6］，但MEK2蛋白第394位點蘇氨酸(Thr394)的磷酸化及其在人結直腸癌發生發展中的影響卻鮮有報道。

本研究旨在通過組織芯片-免疫組織化學的方法檢測Thr394磷酸化的MEK2［p-MEK2(Thr394)］蛋白在結直腸癌、結直腸腺瘤和結直腸旁正常上皮組織中的表達情況，并進一步分析其與結直腸腺癌臨床病理參數及預后的關系，初步探討 p-MEK2(Thr394)在結直腸腺癌發生發展中的作用及臨床意義。

材料和方法

1 材料

本研究共收集2組樣本。第1組:隨機收集2007年5月～2010年12月間中山大學附屬第六醫院結直腸癌病例組織石蠟包埋標本144例，其中結直腸腺癌組織96例，結直腸腺瘤組織24例，癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)24例，所有病例切片均獲病理診斷確認。第2組:隨機收集2000年1月～2005年12月間中山大學附屬第一醫院收治的結直腸癌病例417例，均具備完整臨床病理參數和預后資料。成功取樣并有染色結果的病例為337例，均經病理組織學證實?；颊哳A后隨訪方式:查閱病歷資料;定期電話詢問或通信;家庭訪視。隨訪日期為自首次手術日期開始起，每3個月隨訪1次。生存時間自首次手術之日起計算，隨訪終點為患者死亡日期或末次隨訪日期，隨訪截止時間為2010年8月31日，生存期以月為單位計算。剔除失訪患者后剩余341例納入生存分析。本研究獲中山大學倫理委員會同意，所有參加人員均知情同意。兔抗人p-MEK2(Thr394)單克隆抗體購自Santa Cruz，抗體編號bs5427R。

2 方法

2．1 組織芯片制備 使用切片石蠟制備27 mm×22 mm×10 mm的受體蠟塊，并于蠟塊構建12×8共96點組織陣列，2個相鄰樣本間距為1 mm。由資深病理科醫生在40倍顯微鏡像下確認并定位標記供體組織蠟塊，用組織芯片制作儀(Alphelys)穿取直徑1．0 mm供體組織放入受體蠟塊中，每一標本選取2個位點。用石蠟切片機對組織芯片蠟塊進行連續切片，厚度為4μm。

2．2 免疫組織化學法檢測 采用EnVision染色法檢測p-MEK2(Thr394)在各組織中的表達部位及強度。主要步驟如下:常規脫蠟入水，玻片置3%H2O2中10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，置檸檬酸鈉抗原修復液(pH=6．0)高溫20 min，PBS沖洗3次，加I抗并4℃恒溫過夜;PBS沖洗4次，加II抗HRP液37℃避光孵育1 h，PBS沖洗4次，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。PBS代替I抗作為陰性對照，結直腸癌組織陽性切片作為陽性對照。

2．3 結果判讀及評分標準 p-MEK2(Thr394)陽性表達信號為細胞漿或細胞核中出現黃色物且其染色強度高于背景非特異染色者，或棕黃色顆粒沉淀。采用雙盲法閱片，根據陽性細胞百分數和著色強度綜合記分。陽性細胞著色強度評分:0分為陰性(不顯色)，1分為弱(淺灰黃色)，2分為中(淡黃色)，3分為稍強(黃色)，4分為強(棕黃色)。陽性細胞百分率:0分為無陽性細胞，1分為陽性細胞 1% ～25%，2分為陽性細胞26% ～50%，3分為陽性細胞51% ～75%，4分為陽性細胞76% ～100%。結果判讀采用半定量積分分級:積分=染色強度×染色細胞比例。當同一標本的2個組織芯片評分結果不一致時，取兩者的平均值。

3 統計學處理

采用SPSS18．0統計軟件處理。應用χ2檢驗分析p-MEK2(Thr394)在不同組織中的陽性表達差異及其與各項臨床參數的相關性。采用Kaplan-Meier方法分析p-MEK2(Thr394)表達與結直腸癌患者生存的相關性。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 p-MEK2(Thr394)蛋白的表達情況

p-MEK2(Thr394)蛋白在癌旁正常黏膜和腺瘤組織中表達均位于胞漿，未見明顯胞核染色。在腺癌組織中有4例表達位于胞核和胞漿，剩余陽性表達者均位于胞核，見圖1。根據評分標準，在本組144例標本中，p-MEK2表達的平均值為7．36，以≥7分定義為高表達、＜7分為低表達分為2組。24例癌旁正常黏膜標本均為高表達(100%)，未見低表達(0%)，平均值 15．41;24例腺瘤標本中，平均值7.66，16 例高表達(66.7%)，8 例低表達(33.3%)。96例腺癌標本中，表達平均值3.83，19例高表達(19.8%)，77例低表達(80.2%)。經過統計學分析:三者總體比較有顯著差異(χ2=58．93，P ＜0.01)。p-MEK2在癌旁正常組織中的表達明顯高于結直腸腺瘤組織(χ2=9．60，P ＜0．05)，也明顯高于結直腸癌組織(χ2=53．72，P ＜0．01)，在結直腸腺瘤組織中表達明顯高于癌組織(χ2=20．42，P ＜0．01)，見表1。96例CRC中的p-MEK2(Thr394)的異常表達與各臨床病例參數之間均無相關性，見表2。

Figure 1．Immunohistochemical staining of colorsctal cancer tissues for p-MEK2(×400)．A:negative(0 score);B:positive(1score，yellowish gray);C:positive(2 score，pale yellow);D:positive(3 score，yellow);E:positive(4 score，brown)．圖1 p-MEK2在結直腸癌組織中的表達

表1 p-MEK2(Thr394)在結直腸正常黏膜、腺瘤和腺癌中的表達Table 1．p-MEK2(Thr394)expression in normal mucosa，adenoma，adenocarcinoma of colorectum

2 第2組樣本中p-MEK2(Thr394)蛋白的表達情況

第2組結直腸癌標本組中，成功取樣并且有染色結果的共337例，表達的平均值為4．36。以＞4分定義為高表達，≤4分為低表達，共分為2組，其中203 例低表達(60．2%)，134 例高表達(39．8%)。p-MEK2與性別、年齡、大體分型、組織分型、分化程度、TNM分期等參數均無明顯相關性(P＞0．05)，見表3。

表2 第1組病例中p-MEK2(Thr394)表達與結直腸癌臨床病理參數的關系Table 2．The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristics in the first group

3 p-MEK2的表達同結直腸癌預后的相關性

Kaplan-Meier分析表明，p-MEK2的表達同結直腸癌患者5年生存率無明顯相關性，log-rank檢驗P ＞0．05，見圖2。

4 p-MEK2在胞漿及胞核中的表達

在第2組結直腸癌標本中，p-MEK2也存在胞漿及胞核中同時表達的現象。合并2組結直腸癌標本數據，共有24例(5．6%)標本存在漿核陽性。比較胞漿表達與胞漿胞核同時表達，2組的臨床病理參數及預后均無顯著差異(P＞0．05)，見表4。

討 論

作為MAPK信號通路的最下游，ERK1/2蛋白的活性范圍及持續時間，是細胞對外來刺激反應的重要決定因素。在細胞內存在著多種關鍵調節機制，來維持ERK1/2蛋白的激活與失活之間的平衡。這種平衡對于維持細胞正常的增殖、分化及凋亡，起著重要的作用。ERK1/2蛋白激酶的失活主要靠去磷酸化已被磷酸化的蘇氨酸和(或)絲氨酸來完成。生物學和基因學的研究表明，有活性的ERK1/2蛋白可以在體內被特異性的酪氨酸磷酸酶和雙特異性MAPK磷酸酶失活，從而起到負性調節ERK1/2和其它MAPK蛋白激酶的活性［7-9］。但是，關于 ERK MAPK通路本身各級激酶對ERK1/2活性影響的卻大多數集中在正性調節上。

MEK1/2作為ERK MAPK通路的中心組成部分，同時也是目前已知僅有的2個ERK1/2蛋白激活酶，是我們目前研究腫瘤靶向治療的又一熱門潛在靶點。抑制MEK1/2可以通過阻斷異常的信號轉導，抑制腫瘤細胞的分化、增殖。這種抑制同時還有不受上游異常癌基因(K-ras和BRAF突變)影響的優點?，F在已有多種 MEK抑制劑進入臨床試驗［10-11］。目前關于MEK1/2蛋白與腫瘤的發病機制的研究只集中于激酶領域，存在于MEK2蛋白C末端第394位的蘇氨酸殘基卻從未被報道過。本實驗通過免疫組化的實驗方法將p-MEK2蛋白的表達狀況與結直腸癌發生、發展的不同階段聯系起來，研究Thr394位點磷酸化在結直腸癌發生發展中的作用。

近年來的研究表明，MAPK信號通路在結直腸癌的形成中大都處于異常激活狀態［12］。Deng等［13］通過對123例結直腸癌的免疫組化研究發現，激活狀態的MEK1/2在76%(93例)結直腸癌中高表達，而在正常腸上皮組織中只有很弱的表達，或者不表達。這恰恰與p-MEK2(Thr394)的表達呈相反趨勢。本研究檢測p-MEK2(Thr394)在結直腸正常上皮組織、腺瘤和腺癌組織中的表達情況，其表達呈明顯的遞減趨勢，高表達率分別為100%、66．7%和19.8%。統計學結果顯示三者總體比較具有顯著差異(P＜0．01);三者的兩兩比較也具有顯著差異。二者這種截然不同的表達結果提示我們:在結直腸癌的發展過程中，MEK2第394位點蘇氨酸殘基的磷酸化，在某種意義上可以作為一種保護因素，抑制癌癥的發生。正是這種抑癌因素與促癌因素(MEK1/2異常激活)之間的平衡被打破，正常的腸上皮細胞開始向腫瘤轉化。

表3 p-MEK2的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系Table 3．The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

Figure 2．Kaplan-Meier analysis of association between p-MEK2 expression and survival rate of colorectal cancer patients．圖2 p-MEK2的表達水平與結直腸癌患者5年生存率的關系

表4 p-MEK2在2組腺癌標本胞漿、胞核中的陽性表達Table 4．The positive expression of p-MEK2(Thr394)in the cytoplasm and nucleus of adenocarcinoma samples

本研究另外一個目的是研究p-MEK2(Thr394)蛋白表達與結直腸癌患者的各種臨床參數及預后的相關性。通過不同的統計學分析，我們發現，p-MEK2(Thr394)蛋白的表達與結直腸癌的各種臨床參數(如年齡、性別、分化程度、分期)以及預后均無明顯相關性，這個結果提示我們，p-MEK2(Thr394)的失表達可能對腫瘤的發生階段起著重要的調控作用，但在腫瘤的進展過程中，其下游其它因子的作用更大。

本研究同時還發現，在 2組的 p-MEK2(Thr394)陽性表達的結直腸癌標本(共300例)中，44例同時存在于胞漿及胞核中。激活狀態的MEK1/2可以在胞漿及胞核中表達，這種現象已經在Deng等［13］的實驗中得到證實。Georgieva 等［14］則對其機制和作用進行了研究。他們的研究表明，激活狀態的MEK1/2可以自由地進出于胞漿及胞核之間。MEK1/2進入胞核主要靠被動擴散機制，它由胞核進入到胞漿則是靠其位于蛋白N端的一個短的富含亮氨酸的信號肽。這條肽鏈又稱核轉出信號肽(nuclear export signal，NES)，它位于 MEK1/2 蛋白的第31號氨基酸殘基到第51號殘基之間。NES信號肽的存在使得MEK1/2可以以主動轉運的形式回到胞漿，正是這種主動轉運使得與MEK1/2結合的ERK1/2可以在胞漿重新定位，這也是目前我們已知的唯一一個轉運 ERK1/2出胞核的途徑［15］。p-MEK2(Thr394)蛋白也存在N端的NES肽段，它在細胞核中的表達提示，Thr394的磷酸化也可能存在對ERK1/2重新定位的調節。

盡管目前我們對于Thr394這個位于MEK2 C端的氨基酸殘基知之甚少，但在本實驗中它在結直腸癌的發生過程中的明顯失表達的現象告訴我們，它可能是結直腸癌發生過程中的一個潛在保護因素。MEK2在Thr394的磷酸化值得我們進一步深入研究。