單核細胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的構建

李勝軍，閻雪晶，王艦

（中國醫科大學1.基礎醫學院免疫學教研室；2.第95期臨床醫學七年制；3.基礎醫學院病原生物學教研室，沈陽110001）

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）廣泛存在于自然界中，是一種人畜共患病的病原菌，能通過污染的食品引起人、畜的李氏特菌病，易感者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人和免疫功能缺陷者，感染后主要表現為食物中毒、敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多［1～3］。在LM感染過程中，LM對宿主細胞的黏附發揮關鍵性作用，這種黏附與LM的一些表面蛋白有關，如InlA、InlB、VIP、SrtA、纖維黏連蛋白結合蛋白（FbpA）等［4］。FbpA有570個氨基酸，與肺炎鏈球菌表面的黏附分子PavA、化膿性鏈球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主細胞過程中發揮重要作用［5］。本研究通過PCR從LM基因組中擴增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并構建可用于其基因敲除的質粒，將基因敲除質粒導入LM后，通過同源重組的方法構建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）以便進一步研究其致病機制及fbpa基因功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及培養基：LM1b1684標準株、大腸桿菌DH5α菌株、質粒pCRⅡ、pAULA（中國醫科大學免疫學教研室），胰酶大豆肉湯（Tryptic Soy broth，TSB）、溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養基（美國BD Biosceneces公司）。

1.1.2 實驗試劑：限制性內切酶BamHⅠ、KpnⅠ、SalⅠ 、 堿 性 磷 酸 酶 、DNA Marker DL1000、DNA Marker DL2000（日本TaKaRa公司），T4 DNA ligase（美國Promega公司），基因組DNA小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（碧云天生物技術研究所），細菌PCR試劑盒（美國GENERON公司），Plasmid mini kitⅠ（美國 Omega公司），Western blot試劑盒（藍基生物科技）。

1.1.3 實驗儀器：PTC-200型PCR擴增儀（美國MJ RESEARCH公司），MUPID電泳儀（美國Advance公司），GDS-8000型全自動凝膠成像分析儀（美國UVP公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 LM、Δfbpa和大腸桿菌DH5α菌株的培養：LM、Δfbpa以TSB培養基，大腸桿菌以LB培養基，37℃、120 r/min培養。

1.2.2 LM基因組DNA的制備：收集過夜培養的LM，按基因組DNA小量抽提試劑盒說明書抽提基因組DNA，置于-20℃冰箱凍存備用。

1.2.3 fbpa（IMO1829）及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）片段的克隆及擴增：取10 ng基因組DNA為模板，采用正向、反向引物（表1）進行全序列擴增，反應條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72℃55 s，72℃4 min，30個循環，72℃10 min。PCR 產物經2%瓊脂糖電泳后，按DNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。回收片段與載體質粒pCRⅡ相連，分別常規轉化大腸桿菌DH5α，平板培養并篩選出陽性克隆，LB培養基37℃恒溫振蕩過夜培養，收集菌體，按Plasmid mini kitⅠ試劑盒說明書提取質粒。獲得的質粒分別命名為pCRⅡ-fbpa、pCRⅡ-IMO1828、pCRⅡ-IMO1830。分別以 KpnⅠ、BamHⅠ、SalⅠ限制性內切酶雙酶切3種質粒，經2%瓊脂糖電泳后，回收目的基因片段，置于-20℃冰箱凍存備用［6］。

1.2.4 敲除質粒的構建：采用KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切，將pAULA載體質粒線性化，采用堿性磷酸酶進行線性化載體質粒尾端去磷酸化，防止自連，經1.25%瓊脂糖電泳后，膠回收、純化載體。取前一操作制備的上游基因片段（534 kb）與線性化的pAULA載體在14℃連接過夜。連接物常規轉化大腸桿菌DH5α，陽性克隆采用KpnⅠ、BamHⅠ限制性內切酶雙酶切鑒定。獲得的質粒命名為pAULA-upstream。按照如上操作，以BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pAULA-upstream，連接下游基因片段（575 kb）與線性化的pAULA-upstream，常規轉化大腸桿菌DH5α，獲得的質粒命名為 pAULA-Δfbpa［5］。

1.2.5 基因敲除菌株的構建：將pAULA-Δfbpa質粒與LM放入2 mm電轉杯，在2.5 kV、5 ms條件下將pAULA-Δfbpa質粒轉入LM后實現同源重組，LBEm培養篩選出溫度敏感突變株［7］。

1.2.6 蛋白質提取與Western blot鑒定：LM、Δfbpa經TSB培養基37℃振蕩過夜培養，收集菌體，超聲裂解細菌，15000 r/min、4℃離心15 min，取上清5 μL進行定量，蛋白定量后取30 μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜，恒壓轉移至PVDF膜上，按Western blot試劑盒說明書進行FbpA鑒定。

2 結果

2.1 fbpa（IMO1829）基因及其上下游基因片段的克隆及鑒定結果

將PCR擴增的fbpa及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）與pCRⅡ連接后，分別常規轉化大腸桿菌DH5α，擴增后抽提質粒，雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示fbpa、IMO1828、IMO1830基因片段成功克隆（圖1）。

2.2 敲除質粒構建及鑒定結果

構建的敲除質粒pAULA-Δfbpa采用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定得1109 bp和未切完全的原質粒（約9 kb）2個條帶的克隆為陽性克隆（圖2）。

2.3 敲除菌株鑒定結果

抽提LM、Δfbpa的基因組DNA，采用fbpa基因正向、反向引物，PCR擴增，PCR產物電泳結果顯示Δfbpa基因組DNA無fbpa基因片段（圖3）。LM、Δfbpa過夜培養后，收集并超聲裂解細菌，提取蛋白并定量后，進行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測，結果顯示Δfbpa無FbpA蛋白表達（圖4）。

2.4 敲除菌株生長特性鑒定結果

LM、Δfbpa過夜培養，以5%的接種量轉接到新鮮的100 mL TSB培養基中，37℃、120 r/min培養，分別在0、1、2、4、6、12、24 h 檢測菌體的生長情況，敲除菌株與標準菌株生長趨勢基本一致（圖5）。

3 討論

LM是廣泛存在于自然界中經由食物傳染的革蘭陽性菌，可以引起人和動物的各種感染癥，感染后主要表現為食物中毒、敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多［1～3］。LM可侵襲宿主專職及非專職吞噬細胞，侵襲過程包括侵入宿主細胞、裂解吞噬溶酶體或內溶酶體、在細胞質內增殖、細胞與細胞之間的傳播等［8～11］。

LM對宿主細胞的黏附發揮關鍵性作用，這種黏附與LM的一些表面蛋白有關，如InlA、InlB、VIP、SrtA、FbpA 等［4］。FbpA 有570個氨基酸，與肺炎鏈球菌表面的黏附分子PavA、化膿性鏈球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主細胞過程中發揮重要作用［5］。

在研究細菌表面黏附分子FbpA在LM感染癥發病機制中的作用時，有必要表達并提純重組FbpA蛋白及構建fbpa基因敲除菌株。本文作者已表達并提純重組FbpA蛋白。在本研究中，我們通過PCR從LM基因組中擴增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并構建可用于其基因敲除的質粒，將基因敲除質粒導入LM后，通過同源重組的方法構建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）。本研究成果有利于進一步研究FbpA蛋白在LM侵襲宿主細胞過程中，對LM黏附宿主細胞、LM從吞噬溶酶體或內溶酶體逃脫、LM在細胞質內的增殖、LM在細胞與細胞之間的傳播的影響。

［1］胡昕，諸葛青云，潘長旺，等.溫州市海洋貝類微生物污染狀況的調查［J］.南方醫科大學學報，2010，30（7）：1624-1625.

［2］馮延芳，冉陸，張立實.2000-2009年中國李斯特菌病文獻報告病例分析［J］.疾病監測，2011，26（8）：654-659.

［3］Allerberger F，Wagner M.Listeriosis：a resurgent food borne infection［J］.Clin Microbiol Infect，2010，16（1）：16-23.

［4］Mostowy S，Cossart P.Virulence factors that modulate the cell biology ofListeriainfection and the host response ［J］.Adv Immunol，2012，113：19-32.

［5］Innocentin S，Guimar觔es V，Miyoshi A，et al.Lactococcus lactis expressing eitherStaphylococcus aureusfibronectin-binding protein A orListeria monocytogenesinternalin A can efficiently internalize and deliver DNA in human epithelial cells［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（14）：4870-4878.

［6］張育先，白啟軒，馬超，等.人脂聯素真核表達質粒構建及其在LX-2 中的表達［J］.首都醫科大學學報，2009，30（3）：326-330.

［7］Sch覿ferkordt S，Chakraborty T.Identification，cloning，and characterization of the Ima operon，whose gene products are unique toListeria monocytogenes［J］.J Bacteriol，1997，179（8）：2707-216.

［8］Cossart P，Bierne H.The use of host cell machinery in the pathogenesis ofListeria monocytogenes［J］.Curr Opin Immunol，2001，13（1）：96-103.

［9］Vazquez-Boland JA，Kuhn M，Berche P，et al.Listeriapathogenesis and molecular virulence determinants ［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14（3）：584-640.

［10］Cossart P.Actin-based motility of pathogens：the Arp2/3 complex is a central player［J］.Cell Microbiol，2000，2（3）：195-205.

［11］Stavru F，Archambaud C，Cossart P.Cell biology and immunology of Listeria monocytogenesinfections：novel insights ［J］.Immunol Rev，2011，240（1）：160-184.